Явление андрогенеза в культуре пыльников (микроспор) впервые описали в 1964 г. индийские ученые С. Гуха и С. Магешвари.
В результате отклонения от нормального развития микроспора может перейти к:
- прямому андрогенезу, при котором гаплоидный зародыш возникает прямо из микроспоры без каллусообразования,
- непрямому андрогенезу, при котором репродуктивные клетки дедифференцируются, делятся, образуют каллусную ткань, в которой индуцируется органогенез и затем формируются растения.
В первом случае микроспора делится и образует 40-50-клеточный проэмбрион. Зародыш разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные развитию зиготического зародыша:
- глобулы,
- сердца,
- торпеды,
- молодого проростка.
При втором варианте пыльца тоже делится, но образовавшиеся клетки быстро увеличиваются в размере и, разрывая оболочку пыльцевого зерна, образуют массу каллуса. Так, при культивировании пыльников риса, пшеницы, тритикале, ячменя из микроспор обычно возникает каллус, а для табака свойственен прямой андрогенез. У картофеля, томатов, хлопчатника наблюдается появление и эмбриофитов, и каллусов из микроспор.
Каллусная ткань из пыльников не всегда способна к морфогенезу, поэтому прямой эмбриогенез из микроспор более перспективен и особенностям этого процесса отводится основное внимание исследователей.
Регенерированные разными путями растения могут сильно различаться. При андрогенезе образуются истинные гаплоиды, а из каллуса можно получить ди-, три-, тетра- и т. д. эуплоиды и анеуплоиды. Отсюда идентификация гаплоидов - важный и необходимый этап работы. С этой целью используют различные методы. Первым подсчитывают число хромосом в делящихся клетках корня, число пластид в замыкающих клетках устьиц. Второй метод отличается наибольшей простотой. Он основан на том, что у гаплоидов число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц почти в 2 раза меньше, чем у диплоидов. Могут возникать и другие генетические изменения - образуются растения-альбиносы в культуре пыльников злаков.
На переход к андрогенезу влияет ряд факторов.
Генотип. Например, у 21 сорта Triticum aeslivum образование гаплоидного каллуса составляло от 0 (10 сортов) до 1,6-1,7 % (6 сортов), у 20 генотипов мягкой пшеницы частота образования каллуса составляла oт 1 до 66 %. Изучение образования каллуса у пыльников разных сортов риса и их гибридных потомков показало, что способность к индукции каллуса наследуется простой рецессивный признак. У картофеля выявлены генотипы с высокой потенцией к образованию каллусов (сорта Гибридный, Гатчинский, Свитанок, Искра , Полесский розовый).
Физиологические факторы (приведем только важнейшие, которые нужно оптимизировать):
- возраст и физиологическое состояние растения- донора;
- стадия развития пыльцы;
- состав питательной среды;
- положение цветочной почки на растении;
- время от начала зацветания.
Имеются также частные (неосновные) факторы, слабо влияющие на андрогенез:
- способ культивирования (поверхностное или суспензионное);
- температурная предобработка пыльников;
- влияние освещения;
- применение активированного угля.
Так, выращенные в поле растения-доноры превосходят полученные в тепличных условиях; цветки (колосья), образовавшиеся в начале цветения, предпочтительнее появившихся позже; оптимальные условия освещения, питания и водного режима также благоприятны для хорошего результата. Оптимальный срок изолирования пыльников - стадия «средних» или «поздних» микроспор, когда они, выйдя из тетрад, вакуолизируются и готовятся к первому митозу.
Для массовых работ по выделению пыльников нужно установить корреляции между стадией развития микроспор и пыльцы, с одной стороны, и размерами цветочной почки или венчика цветка - с другой. Состав питательной среды хотя имеет меньшее значение, чем стадия развития пыльцы, но все же важен. Используют определенные среды, например:
- 1/2 солей среды МС для пасленовых;
- китайская среда № 6 и среда с картофельным экстрактом для злаков;
- иногда - среду Нича.
Для пасленовых андрогенез показан без добавления ауксинов, тогда как злаковые и крестоцветные требуют наличия 2,4-Д. Агар-агар, возможно, имеет некоторые компоненты, токсичные для пыльников. Когда его заменяли на более очищенную агарозу, то улучшилось культивирование пыльников риса, пшеницы, ячменя (в то же время необходимо учитывать высокую стоимость агарозы).
Удачный вариант - выращивание изолированных пыльников в жидкой питательной среде над слоем агаризованной среды, в которую добавлен активированный уголь. Он используется для адсорбции токсичных веществ, выделяемых пыльниками. Возможно, уголь нормализует и стабилизирует уровень фитогормонов в пыльниках либо связывает ингибиторы фитогормонов, в результате чего стимулируется эмбриогенез. Данный способ был применен при получении гаплоидов в культуре пыльников картофеля.
Для стимуляции андрогенеза используют предобработку изолированных пыльников пониженной температурой (4-6 °С), для разных видов различной длительности - от 2 до 28 суток. Это можно рассматривать либо как способ задержки процессов развития микроспор и сохранения их жизнеспособности, либо как стресс, меняющий программу развития пыльцы. Видимо, второе предположение вернее. Изолированные пыльники обычно культивируют в темноте или при слабом освещении. При культивировании пыльников дедифференцировка и каллусогенез может происходить не только в репродуктивных клетках, но и в соматических тканях. В последнем случае культура клеток и регенеранты будут гетерозиготными диплоидами. Чтобы избежать этого, культивируют не изолированные пыльники, а изолированные микроспоры, что даст гарантию получения гаплоидных растений.
Гаплоидные растения, предназначенные для селекционной работы, дип- лоидизируют с целью получения гомозиготных диплоидов (дигаплоидов). Для этого применяют обработку колхицином гаплоидных меристем (колхицин останавливает митоз в метафазе, инактивируя механизм веретена) или получают каллус в культуре ткани гаплоидного растения и после его спонтанной или индуцированной полиплоидизации регенерируют диплоиды. Спонтанно возникшие при культивировании пыльников диплоиды могут иметь соматическое происхождение, следовательно, для их использования необходимо доказательство изогенности этих растений.