Тема: Распространение и молекулярная диагностика полиморфизма c1c2 в гене cyp2e1

  • Вид работы: дипломная работа
  • Предмет: генетика
  • Формат файла: MS Word

скачать дипломную работу

скачать презентацию

 

 

ЗАДАНИЕ НА ДИПЛОМНУЮ РАБОТУ

Студент

1. Тема Исследование полиморфизма С1/С2 гена CYP2E1 жителей республики Мордовия.

Утверждена

2. Срок представления работы к защите: 26.06.15 г.

3. Исходные данные для дипломной работы: научные журналы по профилю, научная и учебная литература, интернет источники, опыты

4. Содержание дипломной работы

4.1 Обзор литературы

4.2 Материалы и методы исследования

4.3 Результаты и обсуждение

Руководитель работы                                                             

Задание принял к исполнению                                               

 

РЕФЕРАТ

Дипломная работа содержит 43 страницы, 7 таблиц, 5 рисунков, использованных источников.

ГЕН, ПОЛИМОРФИЗМ, МУТАЦИЯ, CYP2E1, полиморфизм с1/с2, ДНК

Материалом исследования послужила цельная венозная кровь человека от здоровых людей и больных страдающих алкоголизмом.

Цель работы – изучение распространения и молекулярная диагностика полиморфизма С1/С2 гена CYP2E1.

Методы исследования: выделение ДНК из крови с использованием протеиназы K, ПЦР-анализ, электрофорез в агарозном геле, детекция и анализ результатов электрофоретического разделения с помощью программ Gel Explorer: Gel Imager, Gel Analysis.

Степень внедрения – частичная.

Область применения – в молекулярной биологии и медицинской генетике.

Эффективность – внедрение в работу НОЦ «ДНК-диагностики и геномных исследований».

 

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

     1 Обзор литературы

            1.1 Система детоксикации цитохрома Р450 и его представители

            1.2 Ген CYP2E1, строение и локализация

     1.2.1 Полиморфные варианты и мутации гена CYP2E1

            1.3 Популяционно-генетические исследования полиморфизмов
в гене CYP2E1

            1.4 Прикладное значение исследований полиморфизмов
гена CYP2E1

            1.5 Гены и их белковые продукты участвующие
в развитии алкоголизма

     2 Материалы и методы

            2.1 Объект исследования

            2.2 Методы исследования

              2.2.1 Выделение ДНК с использованием протеиназы К

              2.2.2 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)

              2.2.3 Электрофорез ДНК в агарозном геле

            2.2.3.1 Приготовление агарозного геля

            2.3 Статистическая обработка результатов анализа

     3 Результаты и их обсуждение

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ЭПС - эндоплазматической сети

ГАМК - гамма-аминомасляной кислоты

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ПАВ – психоактивные вещества

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ГБ – гипертоническая болезнь

АБП – алкогольная болезнь печени

ОШ – отношение шансов

ДИ – доверительный интервал

ЭЭГ – электроэнцефалография


ВВЕДЕНИЕ

Профессор Кирка Вилгельмсен с сотрудниками из Университета Северной Каролины провели серию экспериментов и сделали вывод, что реакцию организма на алкоголь определяет расположенный в конце 10-й хромосомы ген CYP2E1.

Однако влияние продуктов данного гена на физиологические процессы гораздо шире и определяется различными полиморфными вариантами.

Вариант T полиморфизма RsaI (RsaI c2) способствует повышенной транскрипционной активностью и связан с алкогольной болезнью печени в то время как вариант С полиморфизма PstI (PstI+) соответсвует повышенному риску развития онкологических заболеваний. Вариант C полиморфизма DraI тоже является онкологическим маркером. В европейский популяциях, частоты встречаемости вариантов RsaI c2 и PstI+ составляют 1–3%, встречаемость варианта DraI около 10%. Также риск развития онкологического процесса у людей имеющих данный полиморфизм повышается при употребление соленой пищи и курении, даже в небольшом количестве.

В связи с этим целью нашей работы является изучение основных полиморфизмов гена CYP2E1 у жителей республики Мордовия.

В этой связи нами были поставлены следующие задачи:

1 Дать структурно-функциональную характеристику гену CYP2E1.

2 Изучить основные полиморфные варианты и мутации в исследуемом гене.

3 Провести анализ данных по частоте встречаемости  полиморфизма с1/c2 гена CYP2E1 у жителей республики Мордовии.

 

1 Обзор литературы

1.1 Система детоксикации цитохрома Р450 и его представители

Печень связывает и обезвреживает токсичные вещества с помощью ферментов. Этот процессобычно происходит в два этапа: фаза I и фаза II. На первом этапе отходы и ядовитые вещества химически преображаются, а на втором этапе ферменты печени окончательно обезвреживают их. На первой фазе в детоксикации участвует группа ферментов цитохром Р450. В метаболизме ксенобиотиков участвуют около 30 ферментов. В нем различают две фазы: 1) модификация, создающая или освобождающая функциональные группы, 2) конъюгация - присоединение к последним других групп или молекул. Обычно метаболизм происходит именно в такой последовательности, но при наличии в молекуле ксенобиотика функциональных групп он может сразу же подвернуться конъюгации. Как правило обе фазы, особенно при совместном действии, приводят к увеличению гидрофильности и снижению активности и токсичности молекулы [1-5]. Третьей фазой - уже не метаболизма, а судьбы ксенобиотиков - можно считать связывание и выведение самих ксенобиотиков и их метаболитов из клетки, а затем из организма [55].

В первой фазе наиболее важной является локализованная в основном в мембранах ЭПС система цитохрома Р-450, называемая также микросомальной системой метаболизма или монооксигеназной системой [1, 2, 4, 5]. Основные функции которой – образование в молекуле гидрофильных функциональных групп с детоксикацией десятков тысяч веществ. Важными достоинствами системы являются локализация и высокая мощность на главных путях поступления ксенобиотиков в организм - пищевом (печень и желудочно-кишечный тракт) и дыхательном (легкие) - и многообразие путей метаболизма: гидроксилирование (бензол, фенол, полициклические ароматические углеводороды - ПАУ, барбитураты), эпоксидирование (ПАУ), окисление по сере (аминазин) и азоту (аминазин, никотин), восстановление нитро- (нитробензол, левомицетин) и азогрупп (сульфасалазин), деалкилирование по азоту (морфин, амидопирин), кислороду (кофеин, колхицин) и сере (6-метилтиопурин) и десульфурация (паратион, тиобарбитал). Транспорт атомов водорода и электронов в ЭПС печени при гидроксилировании субстрата (это самый частый и важный случай) происходит следующим образом:

НАДФН-зависимая цепь является ведущей, особенно для гидроксилирования: в ней выше скорость реакций и строго доказано биологическое значение. Указанные реакции превращают, например, фенол в менее опасный пирокатехин:

С6Н5ОН + НАДФН + Н+ + О2

С6Н4(ОН)2 + НАДФ+ + Н2O

Однако этой системе присущи и серьезные ограничения и даже недостатки: 1) слабость или отсутствие во многих жизненно важных органах (сердце, головной мозг), 2) меньшая защита организма при других путях проникновения (слизистые, раны, инъекции), 3) токсификация некоторых веществ. Так, система цитохрома Р-450 превращает хлороформ, хорошее средство для общего наркоза, в боевое отравляющее вещество фосген (СHCl3 Cl2C=O), что объясняет высокую токсичность хлороформа [45,37]. Популярное обезболивающее и жаропонижающее лекарство парацетамол превращается в метаболит, в больших дозах повреждающий печень и почки, - нужна осторожность в применении при заболеваниях этих органов. ПАУ бенз(а)пирен превращается в канцерогенный (вызывающий рак) метаболит дигидроксиэпоксид, следовательно, бенз(а)пирен только проканцероген, а истинным канцерогеном он становится после токсификации системой цитохрома Р-450[12].

Основные функции второй фазы те же, что и первой: увеличение гидрофильности и снижение токсичности ксенобиотиков. Наиболее важные ферменты второй фазы относятся к классу трансфераз[22]. Наиболее широка и многообразна активность семейства глутатионтрансфераз, метаболизирующих тысячи ксенобиотиков. Большинство этих ферментов находится в гиалоплазме, но один из них локализован в мембранах ЭПС и митохондрий, другой - в хроматине.

Ко второй фазе относят и некоторые другие ферменты. Эпоксидгидролаза (эпоксидгидратаза) присоединяет воду к эпоксидам (бензола, бенз(а)пирена и др.), что превращает их в диолы [4]:

Функционирование всех ферментов второй фазы ограничивается тем, что они метаболизируют только те вещества, которые имеют функциональные группы. Именно поэтому эти ферменты чаще включаются после образования или освобождения функциональных групп ферментами первой фазы, то есть во второй фазе метаболизма ксенобиотиков [25,35,43]. Однако трансферазы имеют важные достоинства: 1) они есть во всех клетках, поэтому: 2) функционируют при любых путях поступления ксенобиотиков в организм, 3) осуществляют или завершают детоксикацию, а иногда исправляют ошибки первой фазы. Так, они обезвреживают токсичные метаболиты ПАУ (канцерогены), хлороформа (фосген), парацетамола. Правда, теперь обнаружено, что и эти ферменты могут токсифицировать некоторые ксенобиотики, но это встречается реже, чем для системы цитохрома Р-450 [3, 5-8].

1.2 Ген CYP2E1, строение и локализация

Цитохром СУР2Е1относится к группе генов суперсемейства цитохромов Р-450, ответственных за I фазу детоксикации ксенобиотиков. Цитохром СУР2Е1 метаболизирует этанол и многие известные проканцирогены, такие как нитрозамины, находящиеся в табачном дыме [10.11.12]. В гене СУР2Е1,на сегодняшний день индентифицировано несколько полиморфных локусов. Полиморфизмы, выявленные с помощью эндонуклеаз рестрикции RsaI: G/C(-1259), PstI: C/T(-1019), локализованы в 5, - области гена и находятся в неравновесном сцеплении друг с другом [13,14]. Показано, что мутация гена СУР2Е1, обусловленная транзицией C/T в -1019 позиции нуклеотидной последовательности промоторной области гена, способствует синтезу фермента с повышенной активностью [15].

CYP2E1 - микросомальная монооксигеназа - участвует в первой фазе детоксикации ксенобиотиков и, также, утилизирует этанол на первом этапе, экспрессируется главным образом в печени.

Ген CYP2E1находится на хромосоме 10 в локусе10q24.3-qter и кодирует белок, состоящий из 493 аминокислотных остатков и имеющий молекулярную массу 56 кД. Фермент обнаружен в основном в печени и составляет около 7% от всех изоферментов цитохромов Р-450 [7].

Рисунок 1.2.1.1 -  Хромосома 10

 

Рисунок 1.2.1.2 - Расположение экзонов в гене CYP2E1

Рисунок 1.2.1.3- Структура гена cyp2e1


1.2.1 Полиморфные варианты и мутации гена CYP2E1

Полиморфизмы гена CYP2E1 определяют по рестрикционным эндонуклеазам PstI/RsaI (мутантный аллель CYP2E1*5B), локализованные в 5’-фланкируещем регионе гена [15], при которых мутантный аллель способствует повышенной транскрипционной и ферментативной активности, а также DraI полиморфизм (мутантный аллель CYP2E1*6)[16], расположенный в 6 интроне, для редкого аллеля которого показаны мутации, влияющие на экспрессию гена и каталитическую активность соответствующего белка [17].

Вариант T полиморфизма RsaI (RsaI c2) способствует повышенной транскрипционной активностью и связан с алкогольной болезнью печени в тоже время вариант С полиморфизма PstI (PstI+) соответсвует повышенному риску развития онкологических заболеваний. Вариант C полиморфизма DraI также является онкологическим маркером. В европейских популяциях, частоты встречаемости вариантов RsaI c2 и PstI+ составляют 1–3%, встречаемость варианта DraI около 10%.[12,27,31]

Окислительный стресс, вызываемый этанолом – это основной механизм повреждения печени этанолом. Фермент CYP2E1 производит перекиси водорода и свободных радикалов пероксида и гидроксила. CYP2E1 индуцируется этанолом. Поэтому, изменение активности фермента или его уровня в тканях соответствует измененному риску повреждения тканей организма.[17,28,53]

Полиморфизм c1/c2 в 5’-фланкирующем регионе гена CYP2E1 (-1293G>C) регистрируется рестрикцией Pst I и представлен предковым С1 (410 п.н.) и производным С2 (290 + 120 п.н.; СYP2E1*5B; +Pst I) аллелями. Промоторный полиморфизм –1293G>C гена CYP2E1 увеличивает риск развития гипертонической болезни у мужчин, злоупотребляющих алкоголем.

 

Таблица 1.2.1.1 – Номенклатура аллелей CYP2E1 гена [18]

 

Аллель

Белок

Однонуклеотидные замены

Эндонуклеаза

рестрикции

CYP2E1*1A

CYP2E1.1

 

 

CYP2E1*1B

 

CYP2E1.1

 

9893C>G

TaqI

CYP2E1*1C

 

CYP2E1.1

 

6 тандемов

 

 

CYP2E1*1D

 

CYP2E1.1

6 тандемов

 

 

CYP2E1*1D

 

CYP2E1.1

 

8 тандемов

 

DraI, XbaI

 

CYP2E1*2

 

CYP2E1.2

 

1132G>A

 

 

CYP2E1*3

 

CYP2E1.3

 

10023G >A

 

PstI

 

CYP2E1*4

 

CYP2E1.4

 

4768G>A

 

RsaI

 

CYP2E1*5A

 

CYP2E1.1

–1293G>C

–1053C>T

 

DraI

PstI

 

CYP2E1*5B

 

CYP2E1.1

 

7632T>A

–1293G>C

 

RsaI

DraI

CYP2E1*6

CYP2E1.1

–1053C>T

 

 

CYP2E1*7A

 

CYP2E1.1

7632T>A

 

CYP2E1*7B

 

CYP2E1.1

–333T>A

 

 

CYP2E1*7C

 

–71G>T;–333T>A

–333T>A;–352A>G

 

1.3 Популяционно-генетические исследования полиморфизмов в гене CYP2E

Изучена ассоциация полиморфизмов гена цитохрома P450 2E1 (CYP2E1) с риском развития гипертонической болезни в зависимости от характера употребления алкоголя у неродственных индивидов русской популяции (пациентов с гипертонической болезнью и здоровых добровольцев). Установлены статистически значимые ассоциации аллеля –1293C (ОШ=5.04, 95% ДИ=1.23-20.70, p=0.03) и генотипа –1293GC (ОШ=5.36, 95% ДИ=1.28-22.50, p=0.03) с повышенным риском развития гипертонической болезни у мужчин. Стратифицированный анализ в зависимости от характера употребления алкоголя показал, что у мужчин, злоупотребляющих алкоголем, аллель –1293C (ОШ=6.82, 95% ДИ=1.12-41.70, p=0.04) и генотип –1293GC (ОШ=7.61, 95% ДИ=1.2-48.4, p=0.03) увеличивали риск развития гипертонической болезни. Представленные результаты могут свидетельствовать о том, что при избыточном употреблении алкоголя у носителей аллеля –1293C гена CYP2E1 вследствие повышенной индукции цитохрома генерируются высокореактивные продукты свободнорадикального окисления, приводя к окислительному стрессу и эндотелиальной дисфункции, которые составляют патогенетическую основу формирования гипертонической болезни.. С точки зрения медицинской генетики, ГБ представляет собой мультифакториальное заболевание, возникающее у людей с наследственной предрасположенностью при участии различных факторов внешней среды. Одним из ведущих факторов риска развития ГБ является злоупотребление алкоголем. Ферментом, участвующим в метаболизме этанола, является цитохром Р450 2Е1 (CYP2E1)[22,32,31,33]. Индукция данного фермента происходит при приеме алкоголя и представляет собой главный механизм, посредством которого этанол вызывает окислительный стресс

Стратифицированный по полу анализ позволил выявить статистически значимые ассоциации аллеля -1293С (ОШ=5.04, 95% ДИ=1.23-20.70, р=0.03) и генотипа -1293GC (ОШ=5.36, 95% ДИ=1.28-22.50, р=0.03) с повышенным риском развития ГБ только у мужчин (таблица 5).

Учитывая участие фермента CYP2E1 в метаболизме этанола, представлялось важным оценить зависимость ассоциации промоторного полимор­физма -1293G>C с риском развития ГБ от характе­ра потребления алкоголя у мужчин. Был проведен стратифицированный анализ ассоциации данного полиморфизма раздельно в группах мужчин, злоупотребляющих крепкими спиртными напитками (Л/=68: 28 больных ГБ и 40 здоровых), и мужчин с низким или умеренным уровнем. [16,14,17]

Таблица 1.3.1.1 - Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов гена CYP2E1 в группах людей страдающих алкоголизмом и здоровых добровольцев(Л/=45: 30 больных ГБ и 15 здоровых).

 

Аллели/генотипы CYP2E1

Контроль

Больные ГБ

ОШ (95% ДИ)

Р

Аллель -1293С/-1053Т

0.025

0.039

1.62 (0.72-3.61)

0.24

Генотип -1293GG/-1053CC

192 (95.0)

187 (92.1)

1.64 (0.73-3.71)

0.23

Генотип -1293GC/-1053CT

10 (5.0)

16 (7.9)

1.64 (0.73-3.71)

0.23

Генотип -1293СС/-1053ТТ

0 (0.0)

0 (0.0)

Аллель 7632А

0.079

0.106

1.38 (0.85-2.23)

0.19

Генотип 7632ТТ

171 (84.7)

161 (79.3)

1.44 (0.86-2.40)

0.16

Генотип 7632ТА

30 (14.9)

41 (20.2)

1.45 (0.86-2.43)

0.16

Генотип 7632АА

1 (0.5)

1 (0.5)

1 (0.10-9.65)

0.48

Аллель 9896G

0.111

0.108

0.97 (0.62-1.51)

0.89

Генотип 9896СС

158 (78.2)

159 (78.3)

0.99 (0.62-1.59)

0.98

Генотип 9896CG

43 (21.3)

44 (21.7)

1.02 (0.64-1.64)

0.92

Генотип 9896GG

1 (0.5)

0 (0.0)

0.33 (0.01-8.15)

0.99

 

Таблица 1.3.1.2 - Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов гена CYP2E1 в группах по полу потребления алкоголя (Л/=45: 30 больных ГБ и 15 здоровых)

 

Установлено, что у мужчин с низким или умеренным уровнем потребления алкоголя (2 раза в неделю и менее) аллель -1293С (ОШ=1.20, 95% ДИ=0.17- 8.53, р=0.86) и генотип -1293GC (ОШ=1.23, 95% ДИ^О. 16-9.24, р=0.85) не ассоциировались с риском развития ГБ. Напротив, у мужчин, злоупотребляющих алкоголем, аллель -1293С (ОШ=6.82, 95% ДИ=1.12-41.70, р=0.04) и генотип -1293GC (ОШ=7.61, 95% ДИ=1.2-48.4, р=0.03) в значительной степени увеличивали риск развития ГБ.

По-видимому, при хроническом употреблении алкоголя у носителей аллеля -1293С гена CYP2E1 вследствие повышен­ной индукции цитохрома избыточно генерируются высокореактивные продукты свободнорадикально­го окисления, приводя к окислительному стрессу и эндотелиальной дисфункции, которые составляют патогенетическую основу формирования ГБ.[22,23,18]

Полиморфизм гена семейства CYP2E1, обусловливает индивидуальную пере­носимость алкоголя и риск развития АБП. Проведен сравнительный анализ час­тот полиморфных вариантов этого гена у больных АБП (п=126) и в контрольной группе здоровых лиц (п=120). В результате проведенного исследования выявлено достоверное увеличение частоты встречаемости гетерозиготного генотипа гена CYP2E1 (OR=7,37) у больных АБП в сравнении с контролем. Изменение среди больных АБП частоты полиморфных вариантов данных генов указы­вает на их возможную диагностическую и прогностическую значимость, поскольку они задействованы в патогенезе заболевания. Длительное злоупотребление алкоголем стимулирует продукцию цитохрома Р-450 (CYP2E1), обеспечивая более быструю элиминацию этанола у больных алкоголизмом. Эти нарушения функции МЭОС, наряду с повышенной выработкой ацетальдегида, способствуют снижению обезвреживающей функции печени по отношению к экзогенным токсинам и этанола в том числе [2, 3, 5, 14, 17].

Индивидуальная переносимость алкоголя и риск ущерба здоровью в значительной мере зависят от степени активности этих ферментов, которая запрограммирована генетически. Предполагается, что полиморфные варианты гена CYP2E1 определяют индивидуальные и популяционные различия в чувствительности (толерантности) к алкоголю.

Известно, что длительное употребление алкоголя сти­мулирует продукцию цитохромов Р-450, в частности CYP2E1, избирательно локализованного в гепатоцитах. Активация МЭОС, приводящая к ускорению элиминации этанола у больных алкоголизмом, формирует большое ко­личество его токсических метаболитов, вызывающих окислительный стресс и повреждение печени. У лиц, злоупотребляющих алкоголем, основное значение в метаболизме этанола имеет именно этот путь [3, 5, 7, 9, 17]. Необходимо помнить о том, что цитохром Р-450- зависимая МЭОС, наряду с метаболизмом алкоголя, участвует в детоксикации лекарственных препаратов (например, ацетаминофена, нитрозаминов). Поэтому фармакотерапия алкоголизма и повреждений печени при индукции ферментов системы цитохрома Р-450 приводит к дополнительному повреждению печени активными метаболитами лекарственных препаратов [1, 3, 5].

В результате молекулярно-генетического анализа гена CYP2E1 у больных АБП установлено, что гомозиготные носители мутации не встречались ни среди больных, ни в контроле (табл.6). Необходимо отметить, что частота гетерозиготного по мутации генотипа (С1С2) оказалась выше среди больных АБП (11,12%), чем в группе здоровых мужчин (1,67%). Статистический анализ с использованием критерия 2 выявил существенные различия по распределению частот генотипов между обследованными группами ( 2 = 7,52; Р<0,05). Характерное увеличение частоты гетерозиготных носителей мутации среди больных указывает на возможную прогностическую значимость данного параметра (OR = 7,37)[19,21,48].

Индукция МЭОС, наряду с повышенной выработкой ацетальдегида, способствует дополнительному повреждающему действию на печень [5, 7, 9, 13]. Результаты исследования, показавшие достоверное увеличение частоты гетерозиготных носителей мутации С1С2 гена CYP2E1 среди больных АБП, указывают на прогностическую значимость данного параметра ( 2 = 7,52; Р<0,01; OR = 7,37) в развитии поражения печени при злоупотреблении алкоголем.

Результаты анализа комбинации генотипов полиморфных локусов гена CYP2E1 у лиц с АБП и в контроле представлены в табл.6. У лиц с данной комбинацией генотипов риск развития АБП повышен почти в 7 раз. [34,42,41]

                                                                                        

Таблица 1.3.1.3 Распределение частот аллелей гена CYP2E1 у людей больных АПБ и злоупотребляющих алкоголем и здоровых добровольцев

Примечание  п — объем выборки; р — уровень значимости различий по частотам генотипов и аллелей (комбинаций генотипов); OR — показатель отношения шансов; ДI/IOR — 95%-ный доверительный интервал показателя OR

1.4 Прикладное значение исследований полиморфизмов гена CYP2E1

В последнее время проводится все больше исследований по изучению полиморфизмов гена CYP2E1. Эти исследования имеют очень важное значение в медицинской генетике. С помощью ПЦР анализа можно обнаружить различные генетические полиморфизмы. Очень важно сравнивать частоту полимофного генотипа с нормальным генотипом в различных популяциях. Также большое значение уделяется исследованию внешних факторов. Довольно много проводится исследований посвященных изучению влияния мутагенных факторов (ионизирующие и электромагнитное излучение, УФ, различные химические вещества) на частоту полимофных и мутантных генотипов.  Генетическая диагностика заболеваний до начала развития манифестных форм может предотвратить развитие заболевания или улучшить его клиническое протекание и дальнейший прогноз [7,29,39].

С использованием данных генотипирования полиморфизма генов ФМЭ, социально-биологических и психологических характеристик разработан способ индивидуального прогнозирования риска развития алкогольной зависимости. Полученные данные могут рассматриваться как предикторы алкоголизма, что открывает перспективы для научно обоснованного подхода к раннему выявлению, лечению и профилактике этого заболевания. На основании генотипирования полиморфизма генов ФМЭ, изучения социально-биологических и психологических характеристик разработана статистическая регрессионная модель вероятностного прогнозирования риска развития алкогольной зависимости. Использование модели в практике медико-генетического консультирования, психологической реабилитации, подразделений наркологических служб позволит своевременно формировать группу повышенного риска алкоголизма, оптимизировать и индивидуализировать лечебно-профилактические мероприятия [23,46,59].

1.5 Гены и их белковые продукты участвующие в развитии алкоголизма

Алкоголизм - непростое в генетическом плане заболевание.

Гены, ответственные за возможное развитие алкоголизма, влияют на многие физиологические процессы: на расщепление этанола, сбалансированность работы головного мозга, вкусовые ощущения и т.д. Изменения в этих генах могут вызывать как непереносимость алкоголя, так и тягу к нему. Некоторые генные версии связаны с другими признаками или расстройствами. Следовательно, отклонения в поведении, настроении и разного рода зависимости могут иметь общую первопричину [13,54].

Были идентифицированы особые участки хромосом 1, 2, 4 и 7, в которых по данным хромосомного картирования располагаются такие специфические гены, как АDН4 и GABRA2 (хромосома 4), а также СНRМ2 (хромосома 7).

В основе алкогольной зависимости лежат различные физиологические механизмы

Появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что некоторые варианты генов, которые кодируют рецепторы нейромедиатора гамма-аминомасляной кислоты, ассоциируются со склонностью к алкоголизму.

Как показали исследования, проведенные в рамках программы СОGА, нарушения в гене GABRA2, не сопровождающиеся изменением архитектуры рецептора ГАМКА, связаны с алкоголизмом. Была выявлена также связь между изменениями в гене СНRМ2 и клиническими проявлениями алкогольной зависимости и депрессии. Как и в случае с геном GABRA2, нарушения в гене СНRМ2, влияющие на биоэлектрическую активность мозга и связанные с развитием алкоголизма и депрессии, сопровождаются не структурными изменениями рецепторов, а уменьшением их числа. Гены отвечающие за предрасположенность к алкоголизму представлены в таблице1.

В метаболизме алкоголя участвуют два основных фермента. Сначала под действием алкогольдегидрогеназы этанол превращается в ацетальдегид, а далее ацетальдегид при помощи альдегиддегидрогеназы в ацетат. Работа этих ферментов, скорость их обмена обусловлены генетически и зависят от разных вариантов генов, кодирующих их.

Этанол (этиловый спирт) является достаточно токсичным соединением, и алкоголь наносит вред здоровью, хотя ряд исследований позволяет предположить пользу умеренного потребления, например, красного вина. Как выяснили ученые, все зависит от особенностей метаболизма алкоголя в организме человека.

Белок алкогольдегидрогеназа состоит из альфа-, бета- и гамма-субъединиц, каждая из которых кодируется соответствующим геном. Ген алкогольдегидрогеназы ADH1B кодирует бета-субъединицу белка ADH. На активность фермента может влиять замена одного нуклеотида в кодирующей ее последовательности ДНК. В процессе эволюции образовались два варианта данного гена. Основной вариант обозначается как *1 (или А), а вариант гена, произошедший в результате мутации, – как *2 (или G). Вследствие такой замены меняется активность фермента ADH. Многими авторами было показано увеличение активности фермента до 100 раз у лиц, имеющих генотип *2/*2, по сравнению с людьми, несущими основные варианты гена – *1/*1.

 

Таблица 1.5.1.1 - Гены ответственные за предрасположенность к алкоголизму

Ген; Локализация

Кодируемый белок; функция

Влияние

Связь с другими признаками или заболеваниями

CYP2E1, хромосома 10

Цитохром 2E1 фермент, участвующий в метаболизме этанола

Повышение риска (некоторые генные версии)

ГБ, АБП

АDН4; хромосома 4

Алкогольдегидрогеназа; фермент, участвующий в метаболизме этанола

Повышение риска (некоторые генные версии)

Нет

ALDH1; хромосома 4

Алкогольдегидрогеназа; фермент, участвующий в метаболизме этанола

Непереносимость алкоголя

Нет

CHRM2; хромосома 7

Мускариновый/ацетилхолиновый М2-рецептор; регулирует сигнальные процессы

Повышение риска

Депрессия; изменение характеристик дельта- и тета-волн на ЭЭГ

DRD2; хромосома 11

Дофаминовый D2-рецептор; регулирует активность системы вознаграждения

Повышение риска

Пристрастие к курению

GABRG3; хромосома 15

g3-субъединица ГАМКА-рецептора; регулирует сигнальные процессы

Повышение риска

Нет

НТАS2R16; хромосома 7

hTS2R16-рецептор; влияет на ощущение сладкого

Повышенный риск

Нет

ОРRК1; хромосома 8 РDYN; хромосома 20

Рецептор каппа-опиоида и продинор-фин, пептид, который связывается с этим рецептором; оба белка участвуют в регуляции влечения и отвращения к алкоголю

Повышенный риск

Реакция на стресс; может влиять на пристрастие к героину и

 


2 Материалы и методы

2.1 Объект исследования

Материалом для исследования послужили образцы ДНК, полученные из цельной венозной крови человека. Выборки больных людей с алкоголизмом на базе республиканского наркологического диспансера г. Саранска. Выборка составила – человек больные и  человек здоровые (доноры) в качестве контрольной группы. В исследование были включены больные не родственные между собой.

2.2. Методы исследования

2.2.1 Выделение ДНК с использованием протеиназы К

  1. Лизис эритроцитов
    • В 1,5 мл пробирки внести последовательно 700 мкл цельной крови и 700 мкл буфера ТЕ 1(10 мМ трис-HClи 1мМ ЭДТА). Перемешать со­держимое переворачиванием (8-10 раз).
    • Центрифугировать при 11000 об/мин 6 мин.
    • Супернатант удалить над видимым осадком лейкоцитов. Осадок тщательносуспендировать в 700 мкл буфера ТЕ1. Повторить процедуру 2—3 раза.
  2. Лизис ядер клеток.
    • К отмытому осадку добавить 300 мкл ТЕ 2 (20 мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, pH 7,4), тщательно перемешать и добавить 25 мкл 10% SDS, 10 мкл протеиназы. Инкубировать смесь 65°С 20 мин. Остудить про­бирки во льду 1 мин.
  3. Осаждение ДНК.
    • К лизату добавить 250 мкл 5,3 М NaClдля высаливания белков. Пере­мешать содержимое пробирок на вортексе до появления хлопьев.
    • Центрифугировать смесь 6 мин при 10 тыс об/мин. Перенести супер- натат. содержащий ДНК, в новые пробирки не забирая осадок.
    • Добавить 700 мкл холодного изопропанола. Перемешать переворачи­ванием пробирки 10-12 раз до выпадения видимого осадка ДНК.
    • Центрифугировать смесь при 13 тыс об/мин 2 мин. Осторожно, не за­бирая нитей ДНК, удалить супернатант.
  4. Промывка и растворение ДНК.
    • Добавить 70% этанол до объема 1,5 мл. Встряхнуть на вортексе.
    • Центрифугировать 2 мин при 13 тыс об/мин. Осторожно удалить су­пернатант, не забирая осадок.
    • Открытые пробирки подсушить на воздухе до испарения спирта.
    • Добавить к осадку 300 мкл буфера 0,1 М трис-HClpH 8,5 (НЕ ТЕ!). Перемешать и прогреть при 65°С 5 мин до растворения ДНК.
    • Полученный раствор ДНК хранить при -20°С. Допустимо кратковре­менное хранение раствора ДНК при +4°С.

2.2.2 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Количество копий исследуемого локуса может быть увеличено с помощью амплификации (полимеразно-цепной реакции).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) предусматривает инкубацию образцов при трех температурах, соответствующих трем этапам цикла амплификации: денатурации ДНК, отжигу праймеров и пролонгации синтезируемой цепи. Обычно двуцепочечную ДНК денатурируют путем кратковременного нагрева образца до 90–960 С, затем проводят отжиг, охлаждая образец до 40–650 С, и далее нагревают до 70–75 0С, чтобы осуществить достройку ДНК, начиная с отожженных затравок с помощью Taq-полимеразы.

Инструкция:                                                          

1 Приготовить и пронумеровать пробирки для проведения амплификации вместимостью 0,5 мл (или 0, 2мл) в соответствии с количеством анализируемых проб плюс отрицательный контроль. Для каждой пробы готовят 2 пробирки (N (норма) и P (патология)).

2 За 20–30 минут до приготовления рабочей амплификационой смеси извлечь комплект реагентов для ПЦР  из морозильника, разморозить содержимое. Пробирки с реакционной смесью и полностью размороженным раствором разбавителя тщательно встряхнуть для перемешивания содержимого.

3 Из компонентов комплекта приготовить рабочие смеси реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу:

17,5 мкл разбавителя,

2,5 мкл реакционной смеси,

0,2 мкл Taq-полимеразы

Готовятся 2 рабочие смеси: с реакционной смесью НОРМА и с реакционной смесью ПАТОЛОГИЯ.

  • После добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю очередь, необходимо тщательно перемешать смесь пипетированием.
  • Добавить по 20 мкл соответствующей рабочей амплификационной смеси во все соответствующие пробирки, подготовленные для амплификации.
  • Добавить во все пробирки по 1 капле (около 25 мкл) минерального масла.
  • Внести по 5 мкл образца из обработанной анализируемой пробы в пробирку с рабочей амплификационной смесью НОРМА и в пробирку с рабочей амплификационной смесью ПАТОЛОГИЯ под слой масла. В качестве отрицательного образца вносится разбавитель в объеме 5 мкл в оба типа реакционной смеси.
  • Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 секунд при 1,5-3000 об/мин комнатной температуре (+18..+25° С) на микроцентрифуге-вортексе.
  • Перенести пробирки в прогретый до температуры +94° С (установившейся температура в режиме Пауза) программируемый термостат (амплификатор) и провести амплификацию по следующей программе:

 

При интерпретации результатов важно помнить о невозможности появления в данных анализах слабоположительных проб. Все полосы на электрофорезе должны быть четкими и примерно одинаковой интенсивности (допускаются небольшие различия в яркости как между тестами на норму и патологию, так и от пробы к пробе). Причинами появления малоинтенсивных полос на электрофорезе могут являться:

1 Ошибка при проведении анализа или некорректная работа амплификатора;

2 Частичное вытекание амплификата из кармана (малоинтенсивна как полоса ампликона);

3 Контаминация образца или затекание амплификата из соседнего кармана геля.

Во всех этих случаях необходимо повторить амплификацию и детекцию, а при повторном появлении малоинтенсивных полос - повторить анализ, начиная со стадии выделения ДНК из соответствующей пробы.

Полоса (длина ампликонов для каждого набора указана в таблице в начале инструкции)

Интерпретация резуультата

Реакционная смесь

N (норма)

Реакционная смесь

Р (патология)

 

+

-

Нормальная гомозигота

+

+

Гетерозигота

-

+

Патологическая (мутантная) гомозигота

2.2.3 Электрофорез ДНК в 1,5 % агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле позволяет разделять молекулы ДНК по их размерам. Этот метод основан на сравнительном анализе исследуемого и стандартного препаратов ДНК на фотографии геля, окрашенного бромистым этидием, являющимся интеркалирующим красителем, связывающимся с ДНК. Ультрафиолетовый свет, поглощенный бромистым этидием и ДНК (возбуждение передается на краситель), испускается затем в виде флюоресценции в области видимого света при 590 нм.

Размер фрагментов ДНК определяли путем сравнения их подвижности с маркером (рестрикционные фрагменты фага l). Количественное определение ДНК в агарозном геле проводили путем сравнения яркости полос анализируемых фрагментов и стандартного препарата ДНК.

Минимальное количество ДНК, которое можно увидеть при фотографировании геля, окрашенного бромистым этидием, - 2 нг при ширине полосы 0,5 см (обычная ширина лунки), оптимальное количество - 40–60 нг.

2.2.3.1 Приготовление агарозного геля

Все растворы для электрофореза готовятся заранее.

Для приготовления 1,5 % агарозного геля, мы добавляли 1,5 г агарозы к 100 мл буфера ТВЕ (1х). Нагревали смесь в. кипящей водяной бане до полного растворения агарозы. Охлаждали раствор агарозы до 50–55° С и добавляли бромистый этидий до конечной  концентрации 0,5 мкг/мл.                                                                                                                                     Заливали раствор в специальную электрофоретическую кювету и немедленно вставляли на расстоянии примерно 1 см от одного из концов кюветы гребенку для формирования лунок. Высота гребенки подбирается таким образом, чтобы между ее зубьями и дном кюветы оставался зазор в 0,5–1,0 мм. Оставляли камеру в строго горизонтальном положении до полного застывания геля при комнатной температуре (от 30 до 40 мин). Затем, аккуратно вынимали гребенку и помещали кювету с гелем в электрофоретическую камеру. Заполняли камеру 500 мл электрофоретического буфера ТВЕ (1х), чтобы он покрыл гель слоем.

2.3 Статистическая обработка результатов анализа

Для обработки результатов анализа электрофореза работали с пакетом программ Gel Explorer:

1 Gel Imager – программа для ввода и обработки изображений и устройств видеоввода

2 Gel Analysis – программа анализа изображения гелей. Предназначена для оценки количества и молекулярной массы НК и белков, содержащихся в исследуемых фрагментах.

Популяционно-генетический анализ. Частоту встречаемости аллелей определяли по следующей формуле:

 

    (1)

где рА – частота аллеля А, АА – количество гомозигот, Аа - количество гетерозигот, N – общее количество людей.

Расчет генного равновесия по закону Харди-Вайнберга, выполняли для определения, сохранено ли генное равновесие в данной выборке людей, или оно нарушено.

Соотношение фактических частот генотипов теоретически ожидаемым определяли по критерию χ2.

Статистическую обработку проводили с помощью  t-критерия Стьюдента.


3 Результаты и их обсуждение

Ген CYP2E1 содержит полиморфизм c1/с2, который повышает риск возникновения и развития алкоголизма.

Для молекулярно-генетического исследования полиморфизма c1/с2 в гене CYP2E1 были исследованы фрагменты ДНК, полученные из цельной венозной людей.

Выделение ДНК проводили фенольным методом с использованием протеиназы К. Полиморфизмы генов анализировали методом ПЦР, а разделение фрагментов ДНК проводили методом электрофореза в  1,5% агарозном геле.

В результате электрофоретического исследования на выявление полиморфизма c1/с2 нами были получены электрофореграммы (рисунок 3.1.1.1).

 1   2   3   4    5   6  7     8   9  10    11   12  13  14  15

А)

     1  2  3   4    5   6    7     8    9    10   11  12  13  14   15

Б)

 

Рисунок 3.1.1.1 – Электрофореграммы ядерной ДНК на выявление полиморфизма с1/с2 в гене CYP2E1:

А) норма; Б) патология

В мордовской популяции для полиморфизма с1/с2  в гене CYP2E1, согласно данным статистической обработки, частота нормального гомозиготного генотипа 27% (4 из 15 образцов). Встречаемость гетерозиготного генотипа наблюдалось у 53% (8 из 15 образцов). Встречаемость патологического генотипа составляет 20% (3 из 15 образцов) (рисунки 3.1.1.1 и 3.1.1.2).

Таблица 3.1.1.1 – Частоты встречаемости аллелей и генотипов изучаемого полиморфизма в группе больных и в группе контроля

Выборка

Ген/полиморфизм

Генотипы, %

Аллели,%

1

2

3

4

5

6

7

Группа контроля (n=60)

CYP2E1(1293G/C)

G/G

G/C

C/C

G

C

32

 

n=4

53

 

n=8

8

 

n=3

 

83,3

 

16,7

Группа больных (n=63)

CYP2E1(1293G/C)

27

 

n=4

60

 

n=8

20

 

n=2

 

75,4

 

24,6

 

Рис 3.1.1.2 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма 1293G/C гена CYP2E1

Популяционно-генетический анализ встречаемости частот генотипов по полиморфизму с1/с2 гена CYP2E1 в выборке здоровых и больных с патологиями показал, что частота нормального гомозиготного G/G генотипа в группе больных ниже, чем  в группе контроля на 5 %. (таблица 3.1.1.1, рисунок 3.1.1.2). Встречаемость гетерозиготного G/А и патологического гомозиготного генотипа A/A оказалась выше в группе больных соответственно на 8 и 12% соответственно.

Таким образом цитохром 2E1, также как и другие ферменты суперсемейства P450 в зависимости от того или иного полиморфного варианта кодирующего гена влияют на физиологические и метаболитические процессы организма и нередко приводят к возникновению патологического процесса.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 В ходе выполнения работы нами были изучены:

1 Структура гена CYP2E1, его строение, локализация в хромосоме. Было показано, что данный ген находится в хромосоме 10, в локусе10q24.3–qter имеет молекулярную массу 56 кД. Наличие полиморфизмов в гене CYP2E1, связанно с высоким риском развития алкогольной болезни печени, гипертонической болезни у людей злоупотребляющих алкоголем.

Вариант T полиморфизма RsaI (RsaI c2) характеризуется повышенной транскрипционной активностью и был ассоциирован с алкогольной болезнью печени в то время как вариант С полиморфизма PstI (PstI+) соответсвует повышенному риску развития онкологических заболеваний. Вариант C полиморфизма DraI также является онкологическим маркером.

2 Проведен анализ данных по частоте встречаемости полиморфизмов гена CYP2E1 в различных популяциях. В исследуемой нами группе людей было выявлено для полиморфизма с1/с2  в гене CYP2E1, согласно полученным данным, частота нормального гомозиготного генотипа 27% (4 из 15 образцов). Встречаемость гетерозиготного генотипа наблюдалось у 53% (8 из 15 образцов). Встречаемость патологического генотипа составляет 20% (3 из 15 образцов)

 

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

  1. Парк Д.Б. Биохимия чужеродных соединений / Парк Д.Б - М.:Медицина, 1973. - 288 с.
  2. Арчаков А.И. Микросомальное окисление / Арчаков А.И. – М.: Наука, 1975. - 327 с.
  3. Колесниченко Л.С. Успехи современной биологии / Колесниченко Л.С. Кулинский В.И. - 1989. Т. 107, вып. 2. - С. 179-194.
  4. Саприн А.Н. Успехи биол. Химии / Саприн А.Н. – 1991,Т. 32.- С. 146-175.
  5. Pacifici G.V. Advances in Drug Metabolism in Man / G.V. Pacifici, G.N. Fracchia. Brussels; Luxembourg: Europ. Comis., 1995. 834 p.
  6. Кулинский В.И. Успехи биол. Химии / Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. - 1990. - Т. 31. - С. 157-179.
  7. Кулинский В.И. Успехи современной биологии / Кулинский В.И., Колесниченко Л.С.- 1990. -Т. 51, вып. 1(4).- С. 20-33.
  8. Обезвреживание ксенобиотиков (КУЛИНСКИЙ В.И. , 1999), БИОЛОГИЯ [Электронный ресурс] – режим доступа: http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stsoros/697.html
  9. Баранов В.С. Геном человека и гены «предрасположенности» (введение в предиктивную медицину) / Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В.– СПб.: Интермедика, 2000. - 272 с.
  10. Владимиров Ю.А Свободные радикалы в живых системах. Итоги науки и техники. / Владимиров Ю.А., Азисова О.А., Деев А.И., Козлов АК.В., Осипов А.Н.. Рощупкин Д.И. –Серия биофизика. - М., 1991. - 251 с.
  11. Кулинский В.И. Обезвреживание ксенобиотиков//Соровский Образовательный журнал.- 1999.- №1. - С. 8-12.
  12. Bartsch H, Nair U, Risch A et al. Genetic polymorphism of CYP genes, alone or in combination, as a risk modifier of tobacco-related cancers Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. – 2000. – Vol.9, № 1. - P. 3-28.
  13. Hayashi S., Watanabe J., Kawajiri K. Genetic polymorphism in 5, - flanking region change transcriptional regulation of the human cytochrome P 450 Gene / S.Hayashi, J.Watanabe, K.Kawajiri // J. Biochem. – 1991. – Vol. 110. – P. 559-565.
  14. Huang C.Y. The GSTT1 and CYP2E1 genotypes are possible factiors causing vinyl chloride induced abnormal liver function / C.Y.Huang, K.L. Huang, T.J Cheng et al. // Arch. Tojcjl. – 1997. – Vol.71 –P. 482-488.
  15. Медицинские Диссертации http://medical-diss.com/medicina/gigienicheskoe-znachenie-geneticheskogo-polimorfizma-sistem-biotransformatsii-vysokotoksichnyh-veschestv-u- heloveka#ixzz3c1Db7hSX
  16. Пузырев В. П. Генетика мультифакториальных заболеваний: между прошлым и будущим / В. П. Пузырев // Мед. генетика. – – Т. 2, № 12. – С. 498–508.
  17. Баранов В. С. Геном человека и гены «предрасположенности»: Введение в предективную медицину / В. С. Баранов, В. Е. Баранова, Т. Э. Иващенко, М. В. Асеев. – СПб.: Интермедика, – С. 115–118.
  18. Колчанов Н. А. Регуляция транскрипции генов эукариот: базы данных и компьютерный анализ / Н. А.  Колчанов  // Mol. Biol. – 1997. – T. 31. – C. 581–583.
  19. Kolpakov F. A. GeneNet: a database for gene networks and its automated visualization / A.  Kolchanov, E. A. Ananko, G. B. Kolesov // Bioinformatics. – 1998. – V. 14. – P. 529–537.
  20. Dielis A. W The prothrombotic paradox of hypertension: role of the renin-angiotensin and kallikrein-kinin / A. W Dielis M. Smid, H. M. Spronk, K. Hamulyak, A. A. Kroon ten H. Cate de P. W.  Leeuw // Hypertension. – 2005. –  46: 6: 1236–42.
  21. Интернет ресурс: http:// w.w.w.ncbi.hlm.nih.gov
  22. База данных GenBank [Электронный ресурс] – Режим доступа: http: //www.ncbi.nlm/nih/gov//. – Загл. с экрана.
  23. Интернет ресурс: http://cardiology.eurodoctor.ru/atherosclerosis/
  24. Интернет ресурс: http://medportal.ru/enc/cardiology/infarction/
  25. Интернет ресурс: http:// w.w.w.ncbi.hlm.nih.gov
  26. Esmon Ch. T. Crosstalk between inflammation and thrombosis / Ch. T. Esmon // Maturatis. – 2004. – Vol. 47. – P. 305–314.
  27. Ратнер В. Л. Молекулярная генетика: принципы и механизмы / В. Л. Ратнер. – Новосибирск: Наука, 1983. – 256 с.
  28. База данных Вionet.nsc.ru [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/gnw/genenet //. – Загл. с экрана.
  29. База данных GenBank [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://www.genepassport.ru/description.cgi?gid=28//. – Загл. с экрана.
  30. Nobuyo, MaedaS. Targeted Disruption of the Apolipoprotein (2-111 Gene in Mice Results in Hypotriglyceridemia and Protection fro Postprandial Hypertriglyceridemia / Nobuyo MaedaS, Hao Li, Denise Lee, Paula Oliver, Steven H. Quarfordtg, and Jesus Osadan // THE JOURNAL OF BIOLCICAL CHEMIST. – 2009. – P. 121–122.
  31. Заяц Р. Г. Основы общей и медицинской генетики / Р. Г. Заяц, И. В. Рачковская. – М.: Высш. школа, 2003. – 239 с.
  32. Patrushev L. I. New DNA diagnostic system for detection of factor V Leiden / L. I. Patrushev, E. S. Zykova, A. L. Kayushin, M. D. Korosteleva, I. N. Bokarew, S. G. Leont’en, V. M. Koshkin, E. S. Severin // Thrombosis. Res. – 1998. – Vol. 92. – P. 251–259.
  33. Kyrle P. A. Clinical studies and thrombin generation in patients homozygous or heterozygous for the G20210A mutation in the prothrombin gene / P. A. Kyrle, C. Mannhatter, S. Beguin, A. Stumpflen, M. Hirschi // J. Mol. Diagnostics. – 2000. – Vol. 2. – P. 153–
  34. Single Nucleotide Polymorphism Database: Entrez SNP: updated on 11.08.2009 [Электронный ресурс] – Bethesda : National Institute of Health, USA. – 2009. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP.
  35. Jones T. C. Genetic regulation of endothelial function / C. Jones, A. D. Hingorani // Heart. – 2005. – № 91. – P. 1275–1277.
  36. Буркин М. М.,   Основы наркологии : Учебное пособие / М. М. Буркин, под ред. С. В. Торанская. – Петрозаводск: Карелия, 2002. – С. 64–143.
  37. Журнал«Алкоголизм: Клинические и экспериментальные исследования» (Alcoholism: Clinical & Experimental Research) №2 (1 2011) Ranking  201. – 26 с.
  38. Nelson D. R The P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers, early trivial names of enzymes, and nomenclature /D. R Nelson [Электронный ресурс] PubMed США. –  – №12. – Режим доступа: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7678494‎.
  39. Nelson D. R. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature /D. R. Nelson, L. Koymans, T. Kamataki, J. J. Stegeman, R. Feyereisen, D. J. Wama, M. R. Waterman, O. Goton, M.J. Coon, R.W. Estabrook, D.W. Nebert [Электронный ресурс] Department of Biochemistry, University of Tennessee, Memphis 38163, USA. – 1996.– Feb №6(1)1–42р – Режим доступа: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8845856. 
  40. Nebert D.W.  P450 надсемейства: обновленная информация о новых последовательностей, картирование генов, и рекомендуемая номенклатура. ДНК Cell Biol./ D.W. Nebert  , D. R. Нельсон  , M. J. Кун  Отдел гигиены окружающей среды, Университет Цинциннати медицинский центр, OH 45267–0056– 1991.–№ 10 (1) 1–14.
  41. wikipedia.org/wiki/Кукес (округ)‎ Материал из Википедии, проверенный 2 августа 2011.
  42. URL: http://www.pynny.ru.
  43. Mckinnon D.   Genetic Determinants of Toxic Response
  44. in General Principles of Toxicology, Silbergeld, Ellen, Editor, Encyclopedia of Occupational Health and Safety, Jeanne Mager Stellman, Editor–in–Chief./ D. Mckinnon, Ross, Nebert,W. Daniel  [Электронный ресурс]  International Labor Organization, Geneva.– © 2011.– 15р – Режим доступа: http://www.ilo.org/oshenc/part–iv/toxicology.
  45. Mckinnon D. Genetic Determinants of Toxic Response
  46. in General Principles of Toxicology, Silbergeld, Ellen, Editor, Encyclopedia of Occupational Health and Safety, Jeanne Mager Stellman, Editor–in–Chief./ Mckinnon, Ross, Nebert, W. Daniel [Электронный ресурс]   International Labor Organization, Geneva. – © 2012. – 9р – Режим доступа: http://www.ilo.org/oshenc.
  47. Gonzalez  A schematic pedigree of the development of some XMEs, especially the CYP2 family/ Gonzalez & Nebert, Nelson. – 1996.– 3р.
  48. Pirmohamed M. Genetic polymorphism of cytochrome P4502E1 and risk of alcoholic liver disease in Caucasians/ M. Pirmohamed, N. R. Kitteringham, L.J. Quest, R. L. Allott, V.J. Green, I. T. Gilmore, B. K. Park [Электронный ресурс]  – 1995.– Dec;5(6):351–7 – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
  49. Hayashi S. Genetic polymorphisms in the 5'–flanking region change transcriptional regulation of the human cytochrome P450IIE1 gene / S.Hayashi, J. Watanabe , K. Kawajiri [Электронный ресурс] – – Oct;110(4):559–65 – Режим доступа: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1778977.‎
  50. Mariette V. Genetic polymrphisms in alcohol–metabolizing enzymes and chronic pancreatitis /V. Mariette, H. M. Rene, T. E. Morsche1, M. J. Hennie . Alcohol & Alcoholism Vol. –39, No. 1– pp. 20–24.  
  51. Apweiler R. Universal Protein Knowledgebase./ R. Apweiler et al. UniProt [Электронный ресурс] Nucleic Acids 2004.– Res., 32, D115–D119 – Режим доступа: www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc.
  52. Brill E. Transformation–based error–driven learning and natural language processing: a case study in part–of–speech tagging. [Электронный ресурс]  Comput. Linguist.,–1995.– 21, 543–565р– Режим доступа: ldc.upenn.edu/J/J95/J95.
  53. Blaschke C. et al. Automatic extraction of biological information from scientific text: protein–protein interactions. [Электронный ресурс]  Proc. Int. Conf. Intell. Syst. Mol. Biol.–1999.– P. 60–67– Режим доступа: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10786287.
  54. Cohen P. The origins of protein phosphorylation. [Электронный ресурс]  Nat. Cell Biol.– 2002.–  4, 27–30р – Режим доступа: www.ibgm.med.uva.es.
  55. Collier N. JExtracting the names of genes and gene products with a hidden Markov model. In Proceedings of the 18th International Conference on Computational Linguistics, Saarbruken/ N. Collier, Nobata, and Tsujii [Электронный ресурс]  Germany.– 2000.– P. 201–207 – Режим доступа: dl.acm.org/citation.cfm.
  56. Pirmohamed M. Genetic polymorphism of cytochrome P4502E1 and risk of alcoholic liver disease in Caucasians / M. Pirmohamed, N. R. Kitteringham, L. J. Quest, R. L. Allott, V. J. Green, I. T. Gilmore, B. K. Park [Электронный ресурс]  – 1995.– Dec;5(6):351–7 – Режим доступа: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8747406.
  57. Киржанова В. В. Наркологические расстройства в России / В. В. Киржанова Демоскоп Weekly (электронная версия бюллетеня «Население и общество». – 2007. – № 275–276 7 – Режим доступа: http://demoscope.ru/weekly/2007/0275.
  58. Kalsi   Unraveling the molecular mechanisms of alcohol dependence Trends Genet./ Kalsi  G. et al. [Электронный ресурс]   – 2009. – N 1. – P. 49–55.– Режим доступа: www.unboundmedicine.com.
  59. Cotton N.S. The familial incidence of alcoholism:A review / N.S. Cotton [Электронный ресурс]   J. Stud. Alcohol. – 1979.– N 40. – P. 89 –116 – Режим доступа: www.jsad.com.
  60. Kendler K.S. et al.:  Temperance board registration for alcohol abuse in a national sample of Swedish male twins, born 1902 to 1949 / K. S.   Kendler et al.  [Электронный ресурс]   Gen. Psychiatry. – 1997. – V. 54, N 2. –P. 178–184 – Режим доступа:books.google.ru/books.
  61. Pirmohamed M. Genetic polymorphism of cytochrome P4502E1 and risk of alcoholic liver disease in Caucasians. / M. Pirmohamed, N. R. Kitteringham, L. J. Quest, R. L. Allott, V. J. Green, I. T. Gilmore, B. K. Park [Электронный ресурс]  Pharmacogenetics.– 1995.– Dec; 5(6):351–7 – Режим доступа: www.pynny.ru/information/173.ht‎
  62. Pastorelli R. Genetic determinants of alcohol addiction and metabolism: a survey in Italy / R. Pastorelli, G. Bardazzi, C. Saieva et al. [Электронный ресурс]   Alcohol. Clin. Exp. Res.– 2001.– V. 25, N – рр.221–227 – Режим доступа: www.journal–of–hepatology.eu.
  63. Lucas D. Cytochrome p4502E1 and p4501A1genotypes and susceptibility to cirrhosis or upper aerodigestive tract cancer in alcoholic Caucasians/A. D.  Lucas M.nez C., F.  Floch et al [Электронный ресурс]  Alcohol. Clin. Exp. Res.– 1996. –V. 20. – рр1033– 1037– Режим доступа: www.inserm.fr/content/download.

Электронный адрес для связи artem@vseobiology.ru

© 2015-2017 https://vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Заказать курсовую

^ Наверх