Тема: Генетические методы для диагностики социально значимых заболеваний

  • Вид работы: Реферат
  • Предмет: Генетика
  • Формат файла: MS Word

скачать реферат

Содержание

Введение

  1. Методы диагностики социально значимых заболеваний
  2. Применение метода ПЦР и его преимущества
  3. Суть метода полимеразной цепной реакции (ПЦР)
  4. Применение ПЦР для диагностики туберкулеза
  5. Молекулярно-генетические методы диагностики рака

Заключение

Литература

 Введение

Социально значимые заболевания (ВИЧ-инфекция, наркомания, инфекции, передаваемые половым путём и др.) относятся к наиболее актуальным вопросам современности, стали одним из основных угроз здоровья населения, и, прежде всего, подростков и молодежи. Социальная значимость этих заболеваний требует для проведения эффективной профилактики привлечения не только медицинских работников, но и общественности, органов власти, образования, культуры и др.

Именно молодежь является наиболее уязвимой группой населения, которая быстро вовлекается в эпидемический процесс. Наркомания, ВИЧ-инфекция и инфекции, передаваемые половым путём, тесно взаимосвязаны между собой. Так, одно из ведущих мест в противовенерической работе выходит изучение роли наркомании и проституции в формировании очагов венерических заболеваний. Эта тема до недавнего времени практически не обсуждалась. Актуальность проблемы дополняется тем фактом, что в возрастной структуре венерологической заболеваемости с каждым годом увеличивается доля несовершеннолетних. Социально значимые заболевания представляют собой колоссальный ущерб для общества, связанный с потерей временной и стойкой трудоспособности, необходимостью огромных затрат на профилактику, лечение и реабилитацию, преждевременной смертностью, преступностью.

Постановлением Правительства Российской Федерации от 1 декабря 2004 г. N 715 был утвержден перечень  социально значимых заболевания и перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих. Перечень представлен в таблице.

 

 

                                                                                                  Таблица


Наличие у человека одного из вышеуказанных заболеваний сказывается как на здоровье, так и на качестве жизни. В большинстве случаев процесс принимает хронический характер (а в случае с ВИЧ-инфекции это всегда хронический неизлечимый), таким образом, болезнь медленно, но верно убивает человека. В каждом отдельном случае проходит различное количество времени прежде чем больной потеряет трудоспособность, станет социально дезадапритованным а так же начнутся клинические проявления, приносящие больному страдания. В среднем (при определенных допущениях) этот период составляет 5-15 лет. При этом не стоит забывать о том, что больные данными заболеваниями имеют ограничения в плане трудоустройства и обязаны находиться на диспансерном учете в специализированных заведениях, проходя с определенной периодичностью обследования и курсы лечения.

Опасность данных инфекций для окружающих заключается в высоком риске заражения. [5]

 1. Методы диагностики социально-значимых заболеваний

Достижения генетики и молекулярной биологии последних десятилетий открывают в перспективе принципиально новые возможности в диагностике и лечении социально-значимых заболеваний. Для различных заболеваний используются различные методы диагностики и лечения. Влияние конкретных генетических нарушений, лежащих в основе опухолевого роста, позволило обнаружить специфические молекулярные маркеры. На их основе разрабатываются тесты ранней диагностики опухолей.

Цитологический метод исследования получил заслуженное признание и распространение. Простота и доступность его использования в поликлинических учреждениях, а главное - достоверность позволяют во многих случаях распознавать ранние формы онкологических заболеваний.

Биопсия - иссечение или скусывание кусочка опухоли или подозрительной на опухоль ткани для гистологического исследования Биопсию впервые в мире произвел в 1875 г. основоположник патологической анатомии в России М. М. Руднев. Широкое применение биопсия нашла в онкологических учреждениях, как один из достоверных диагностических методов.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) – метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций "золотым стандартом", проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. [3]

 

2. Применение метода ПЦР и его преимущества

ПЦР изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис. Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, пожалуй, самым точным и чувствительным методом диагностики инфекционных заболеваний.

 ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоемким микробиологическим методам Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохимических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антипенной изменчивостью.

ПЦР-исследование позволяет быстро и достоверно диагностировать инфекционные заболевания в силу ряда преимуществ:

  • универсальность ПЦР-метода (в одном образце биологического материала можно выявить возбудителей нескольких заболеваний). ПЦР-метод позволяет обнаружить чужеродную ДНК в самых различных биологических жидкостях и тканях: крови, слизи, моче, мокроте, соскобе эпителиальных клеток;
  • ПЦР-метод обладает самой высокой чувствительностью в сравнении с другими методами лабораторных исследований;
  • высокая специфичность ПЦР-метода позволяет обнаружить в изучаемом материале участок генома, присущий только конкретному возбудителю заболевания;
  • ПЦР-метод позволяет выполнить исследование биоматериала за 7-8 часов.

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов.ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.). в урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии - для выявления геликобактериоза ; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов. [1]

3. Суть метода полимеразной цепной реакции (ПЦР)

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определенного участка ДНК. В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции.

Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести пробоподготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для забора крови в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести забор материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов. 

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
  • Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
  • Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза),Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
  • Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
  • Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию. ]

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы

Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица.

Tm — температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером. Усредненная формула подсчета Tm для короткого олигонуклеотида (и для длинных ДНК фрагментов), с учетом концентрации ионов K+ и DMSO:

где L — количество нуклеотидов в праймере, K+ — молярная концентрация ионов калия, G+C — сумма всех гуанинов и цитозинов.

В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:

  • GC-состав ~ 40—60 %;
  • близкие Tm праймеров (отличия не более, чем на 5 °C);
  • отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек и димеров;
  • желательно, чтобы на 3’-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР  и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий:

  1. Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—3 мин для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

  1. Отжиг

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 cек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60-72 °C.

  1. Элонгация

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин.

 

Рис. 1: Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94—96 °C. (2) Отжиг при 68 °C (например). (3) Элонгация при 72 °C (P=полимераза). (4) Закончен первый цикл. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2n — 2n, где n — число циклов реакции[15]. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1+E)n, где P — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла.

Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.

Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато». [1]

 

4. Применение ПЦР для диагностики туберкулеза.

Метод особенно актуален для туберкулеза, поскольку эффективен в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, определение которых требует длительного культивирования или сложных питательных сред.

ПЦР-диагностика туберкулеза, как правило, строится на использовании последовательностей ДНК специфичных для всех 4 видов группы туберкулеза. Часто для этих целей используют праймеры для выявления последовательностей IS-элементов, например, IS-986 или IS-6110, поскольку данные мигрирующие элементы характерны только для видов микобактерий группы туберкулеза и присутствуют в геноме микобактерий в числе нескольких копий. Выделение ДНК из чистых культур и клинических образцов (мокроты больных) возможно осуществлять любым приемлемым методом, например, методом Boom с использованием лизирующего буфера на основе гуанидина, тиоционата и двуокиси кремния в качестве носителя ДНК.

Проведение ПЦР-диагностики туберкулеза

В качестве примера праймеров для идентификации микобактерий группы туберкулеза можно привести праймеры, фланкирующие фрагмент размером 245 пар нуклеотидов мигрирующего элемента IS-986, содержащегося в геноме M.tuberculosis в числе 2-8 копий.

Последовательность:

Амплифицированный фрагмент выявляют электрофорезом в 1,6 % агарозном геле.

Данная пара праймеров была проверена на специфичность с использованием в качестве контроля 100 нг/проба ДНК близкородственных микроорганизмов; ДНК возбудителей легочных заболеваний; ДНК микроорганизмов, входящих в микрофлору человека (например, E.coli, S. aureus и др.); образцов ДНК человека.

Испытания данной пары праймеров с параллельным бактериоскопическим и культуральным обследоваванием были проведены на клинических образцах мокроты, полученных от больных с различными клиническими формами туберкулеза. Методом ПЦР возбудитель был выявлен у 90,6% больных туберкулезом, в то время как значительно более длительными по времени микробиологическими методами микобактерии были выявлены только у 39,6% больного.

Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением.

Однако применение метода ПЦР чревато получением большого количества ложноположительных результатов, обусловленных как техническими погрешностями, так и особенностями самого метода. Кроме того, метод не позволяет определять степень жизнеспособности выявляемых микобактерий.

Основным недостатком ПЦР является опасность лабораторной контаминации микобактериальной ДНК. Поэтому в настоящее время разработаны достаточно жесткие сертификационные требования для ПЦР-лабораторий, предусматриваюшие наличие трех изолированных помещений. ПЦР - это сложная современная технология, использование которой требует помимо соответствующей аппаратуры наличия высококвалифицированного персонала.

Таким образом, при постановке диагноза результаты ПЦР являются дополнительными и должны сопоставляться с данными клинического обследования, рентгенографии, микроскопии мазка, посева и даже ответа на специфическое лечение. [2]


5. Молекулярно-генетические методы диагностики рака

Последние годы ознаменовались большими достижениями в области генетики, полученными, в основном, молекулярно-генетическими и молекулярно-биологическими методами. Многое стало понятно и в механизме злокачественного перерождения (трансформации) клеток, и в формировании опухолевого очага. Показано, что от первой генетической поломки в нормальной клетке до ее превращения в высокозлокачественную клетку происходит накопление тысяч случайных дефектов в генах (так называемых мутаций), и среди них несколько мутаций должно быть обязательно в генах, отвечающих за регуляцию клеточного деления или запрограммированной клеточной гибели.

Известно, что в нормальных клетках мутации очень редки. В среднем за жизнь человека в нормальных клетках происходит не более двух мутаций. До последнего времени оставалось непонятным, почему в клетках, вставших на путь злокачественной трансформации, за несколько лет накапливаются тысячи мутаций. Оказалось, что в неблагоприятных условиях в клетках развивается состояние генетической нестабильности, когда вероятность мутаций повышена. По окончании экстремальных воздействий клетка возвращается в состояние генетической стабильности. Возможно клетки, остающиеся генетически нестабильными после окончания неблагоприятных воздействий, и являются предопухолевыми, постоянно накапливающими груз мутаций. Во всяком случае трансформированные клетки всегда генетически нестабильны.

Поломку генов у клеток, вставших на путь злокачественной трансформации, в популярной литературе часто сравнивают с движением автомобиля и поведением водителя. Так, протоонкогены, т.е. гены, способствующие делению клеток, сравнивают с педалью газа в автомобиле. Гены-супрессоры опухолевого роста, т.е. ограничивающие клеточное деление, сравнивают с тормозной системой у автомобиля. На начальных этапах озлокачествления клеток обычно страдают протоонкогены, превращающиеся после мутаций в онкогены, а затем в процесс вовлекаются и гены-супрессоры опухолевого роста. Усиленную способность клеток к делению на начальных этапах можно сравнить с желанием водителя утопить педаль газа в пол, когда впереди ровная бетонка до горизонта, а небо безоблачно и воздух свеж. Однако, если мутации затрагивают не только онкогены, но и гены-супрессоры опухолевого роста, то поведение клеток можно сравнить с действием безумного водителя, который не только жмет на педаль газа, но и перерезал тормозные шланги.

В период, когда появляются клинические признаки опухоли, и больной чувствует какие-то неполадки в своем организме, опухоль уже достигает в размере нескольких миллиметров или даже сантиметоров. Клинический период развития опухоли часто составляет 1-2 года, тогда как ее бессимптомное развитие от одной клетки до очага в 2-3 мм продолжается долгие годы или даже десятилетия. Предопухолевый очаг размером до 2-3 мм может дремать годами до тех пор, пока не произойдет мутация в генах, способствующих прорастанию сосудов к опухоли и обеспечивающих, таким образом, ее кровоснабжение, а, следовательно, и возможность дальнейшего увеличения массы.

Еще недавно опухоль можно было диагностировать в большинстве случаев лишь на финишной прямой, после ее прорастания сосудами. Выявить опухоль размером 2-3 мм, особенно если она находилась во внутренних органах, представлялось почти не реальным. И вот здесь на помощь врачам пришли сверхчувствительные молекулярно-генетические методы, позволяющие определять очень малое число измененных (мутантных) участков ДНК, (ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота, носитель наследственной информации в клетках любого живого организма) иногда даже одну мутантную молекулу.

Опухолевые клетки содержат множество мутаций в ДНК, а каждая мутация может стать генетической меткой (маркером) опухоли. Есть гены, мутации которых встречаются в опухолевых клетках особенно часто, - это ген р53-ген-супрессор, т.е. тормозящий опухолевый рост. В норме он сдерживает деление генетически дефектных клеток и заставляет их запускать каскад реакций "самоубийства". Поломки гена р53 позволяют генетически дефектной клетке избежать "самоубийства". Мутации гена р53 встречаются в половине диагностированных опухолей. Другой ген-супрессор опухолевого роста р16, подавляющий клеточное деление в другой точке цикла деления клетки, также неполноценен почти у половины опухолей. В некоторых опухолях обнаруживается онкоген k-ras - мутантная форма одного из ключевых генов - стимуляторов клеточного деления. Существует и еще ряд генов с высокой частотой мутаций в опухолях. Определение мутаций в нескольких генах позволяет выявлять опухоль на ранних этапах развития.

Необходимо упомянуть еще об одной важнейшей особенности опухолей - так называемой клоновости. Как правило, всю массу опухоли (а это миллионы и миллиарды клеток) составляют потомки одной опухолевой клетки, это называется клоном. Вследствие этого во всех клетках присутствуют одинаковые мутации в генах. Таким образом, в клетках опухоли миллиарды молекул ДНК имеют одинаковые мутации в ДНК.

Что же эта закономерность дает для ранней диагностики рака? Среди опухолевых клеток всегда найдутся клетки разрушающиеся или активно выделяющие свою ДНК. Эта ДНК попадает в межтканевые жидкости и далее в кровоток. Если взять кровь и удалить из нее клетки, то в оставшейся плазме крови будут находиться фрагменты ДНК опухолевого происхождения и таким образом можно диагностировать наличие онкологического заболевания.

Подобная мысль приходила ученым давно. Еще в 60е-70е годы в Швейцарии профессором Филиппом Анкером, а в Советском Союзе автором данной статьи делалось много попыток доказать возможность обнаружения в биологических жидкостях ДНК опухолевого происхождения. Однако, чтобы анализировать ДНК опухолевого происхождения в плазме крови при массовых обследованиях, необходима была высокая чувствительность метода. Это стало возможным после разработки полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая позволяет тестировать десятки или даже единичные последовательности ДНК. Поместив ДНК плазмы крови в пробирку, этим методом за полтора часа можно получить миллиард копий дефектного гена, если таковой имеется в организме и далее выявить его с помощью простых лабораторных методов.

Опухоли поджелудочной железы, трудно диагностируемые обычными методами, с помощью ПЦР-анализа гена k-ras в плазме крови удается выявить за 1-2 года до клинического проявления.

ПЦР-анализ гена р53 позволяет выявить опухоли за 4-6 месяцев до их клинического проявления.

Переходя к практической стороне вопроса, необходимо сказать, что ПЦР-анализ по выявлению мутантных генов в ДНК плазмы крови, только начинает внедряться в практику США и в отдельных странах Европы. Большинство же стран Европы и остального мира не имеют пока таких методов. Тем приятней отметить, что ПЦР-анализы генов р53, k-ras, р16 и некоторых других в ДНК плазмы крови проводятся в научно-исследовательской лаборатории Военно-медицинской академии в Санкт-Петербурге.

Помимо ранней диагностики ПЦР-анализы мутантных генов позволяют проводить в ДНК плазмы крови прослеживание опухолевого процесса при лечении онкологических больных. Обычно плазму крови берут до операции, по удалении опухоли, а также спустя некоторое время после удаления и/или после химиотерапии. Например, в случае рака молочной железы это может быть сделано до операции, через 2-8 недель после операции (в зависимости от стадии опухолевого процесса) и после окончания курса химиотерапии. Во всех случаях кровь надо брать не ранее, чем через 2 недели после лечебного воздействия, чтобы избежать ложноположительного результата.

Мутантные гены, анализируемые в качестве своеобразных меток (маркеров), определяются в ДНК, выделенной из парафиновых срезов самой опухоли. "Онкомаркеры" - свидетели присутствия раковых клеток в организме. Их значение для выявления скрытого онкологического процесса очень велико. Если в клетках удаленной раковой опухоли были определенные маркеры, то они обязательно появляются в сыворотке крови или, например, в моче при наличии в организме не менее 1 млн. раковых клеток. Маркеры имеют большое значение для раннего выявления развития таких опухолей, как рак молочной железы, мочевого пузыря, бронхов, предстательной железы, шейки матки, яичников, а также опухоли носоглотки и уха, множественной миеломы и неходжкинских лимфом.

Если какой-либо онкомаркер, например ген р53, выявлен в опухоли и в плазме крови до операции, но не обнаруживается спустя 2 недели после операции и/или после окончания курсов химиотерапии, это означает, что опухолевых клеток или совсем не осталось в организме или их незначительная часть находится в покоящемся состоянии. В любом случае, рецидив или метастазы в ближайшие месяцы маловероятны. Если же мутантный ген продолжает выявляться в ДНК плазмы крови или его количество нарастает, этот показатель предсказывает рецидив или метастазирование. Положительный результат анализа в этом случае может быть использован для смены лечебной тактики, добавления или замены химиопрепаратов, более интенсивного ведения больного, биотерапии и т.д. Подобные анализы выполняются в течение нескольких дней, а значение ответа – ценою в жизнь. [4]

 

Заключение

Наиболее распространенным методом  ДНК диагностики является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Под действием ряда реактивов ДНК возбудителя многократно увеличивается и становится заметной для оборудования, проводящего диагностику. Достаточно находиться всего нескольким возбудителям в пробирке, чтобы тест дал положительный результат. Точность метода ПЦР на сегодняшний день составляет 97% - высочайшая точность по сравнению с микроскопией, которая не всегда может дать правильный ответ даже на 60%. Еще одним положительным моментом ПЦР-диагностики относится то, что может проводиться исследование любого материала - крови, мочи, соскобов и выделений. Фактически на сегодняшний день только ПЦР может быть методом качественной диагностики социально-значимых заболеваний, который заслуживает доверия.

 

Литература

  1. Д. В. Ребриков, Г. А. Саматов, Д. Ю. Трофимов и др. ПЦР в реальном времени М., БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009
  2. Бочков Н. П. Клиническая генетика М., Медицина, 1997
  3. В. Н. Горбунова, В. С. Баранов Введение в молекулярную диагностику и гемотерапию наследственных заболеваний Санкт-Петербург «Специальная литература», 1997
  4. http://onco-med.ru/patient/diagnostics/article03/
  5. http://medinfo.perm.ru/commoninfo

Электронный адрес для связи admin@vseobiology.ru

© 2015-2017 https://vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Заказать курсовую

^ Наверх