Тема: Исследование полиморфизмов в гене 5-НТТ

  • Вид работы: Курсовая работа
  • Предмет: Генетика
  • Формат файла: MS Word

скачать курсовую работу

 

Содержание

Введение

1. Организация гена 5-НТТ

1.1. Структурно-функциональная характеристика гена 5-  строение и локализация

1.2. Полиморфные варианты и мутации гена 5-НТТ и их фенотипическое проявление

1.3. Исследования полиморфизмов в гене 5-НТТ  в различных популяциях

2. Материалы и методы исследования

    2.1. Выделение ДНК из периферической крови (человека и животных)

     2.1.1 Выделение ДНК фенол-хлороформным методом                

     2.1.2. Выделение ДНК для ПЦР из образцов крови набором «МИНИПРЕП»

     2.1.3 Выделение ДНК методом «ДНК-экспресс-кровь»                       

2.2. Проведение ПЦР для определения мутации в гене                               

2.3.  Определение концентрации и чистоты нуклеинових кислот с помощью NanoDrop       

2.4. Электрофорез в ПААГе                                                                          

2.5. Электрофорез в агарозном геле

Вывод

Список литературы

 

Введение

Во время летней практики нами были изучены структура гена 5-HTT, его строение, локализация в хромосоме. Были изучены основные полиморфные варианты и мутации в гене 5-HTT. По изученным данным можно сделать обобщение, что наличие полиморфизмов в гене 5-HTT, связанно с высоким риском развития психических заболеваний и расстройств поведения.

На летней практике студенты 4 курса кафедры генетики должны освоить генетические и биохимические методы для дальнейшей научной работы в рамках научного направления кафедры. Также это необходимо для выполнения курсовых и дипломных работ. Поэтому цель нашей практики заключается в изучении молекулярно-генетических методик.

Для достижения данной цели необходимо решить следующие задачи: усвоить принципы методов выделения ДНК, полимеразной цепной реакции, электрофореза в ПААГе и агарозе, рестрикции и их практического применения в медицинской и сельскохозяйственной практике.

Объект исследования: ДНК, выделенная из периферической венозной крови, ядерные клетки крови.

Методы исследования: выделение ДНК, электрофорез ДНК в агарозном геле и ПААГе, центрифугирование, рестрикция.

Приборы и материалы: приборы и реактивы для выделения ДНК, полимеразной цепной реакции и электрофореза.

 

1. Организация гена 5-НТТ                                                                                 

1.1 Структурно-функциональная характеристика гена 5-НТТ.  Строение и локализация

Этот ген кодирует интегральный мембранный белок, который транспортирует нейромедиатор серотонин от синаптических пространств в пресинаптические нейроны. Кодируемый данным геном серотониновый транспортер (5HTT)  принадлежит к семейству Na+/Cl- - зависимых  транспортеров, функция которых заключается в возвращении неройомедиатора в пресинаптический нейрон после выброса в синапс. Этот белок является мишенью психомоторных стимуляторов, таких как амфетамины и кокаин, и является членом натрия: нейромедиатора symporter семьи. 

Ген 5-НТТ располагается в 17 хромосоме в локусе 17q11.2, рис.1

 

       Рис. 1

 

1.2. Полиморфные варианты и мутации гена 5-НТТ и их фенотипическое проявление

Ген переносчика серотонина имеет в своей структуре полиморфные участки, различающиеся числом повторяющихся последовательностей. Особый интерес представляет участок в области, примыкающей к промотору (5-HTTLPR). Он содержит повторы длиной 22 п.н. Если аллель содержит 16 повторов, его называют длинным (L), если 14 — коротким (S), рис. 2. Показано, что лимфобла- стоидные клетки, содержащие аллель L в гомозиготном состоянии, продуцируют больше мРНК гена переносчика серотонина, чем клетки, содержащие аллель S.

           Рис. 2

Короткие и длинные аллели 5HTT по-разному влияют на транспортер серотонина. При коротком аллеле (S) транспортер серотонина в меньшей степени транскрибируется и, соответственно, в меньшей степени представлен на пресинаптической мембране, чем при длинном (L). S аллель имеет низкую экспрессию и является доминантной. Функциональный полиморфизм 5НТТ гена модулирует  реакцию человека на стрессовые события: те, кто унаследовал два длинных аллеля (LL), имели всегда относительно низкую предрасположенность к депрессии по сравнению с другими генотипами, несмотря на многие травматические события. Таким образом, генетический полиморфизм 5НТТ можно рассматривать как предикт психологической адаптации человека к условиям высоких психологических нагрузок.

Рис.3 Полиморфизм серотонинового транспортера (5HTT)

А- пространственная организация транспортера

Б - полиморфизм промоторной части

В - распределение генотипов 5-HTT в популяция спортсменов

Было исследовано 150 спортсменов: 92 синхронистки, 31 футболист  и 27 хоккеистов. Распределение генотипов 5HТT показывает повышенную встречаемость LL аллеля у спортсменов по сравнению с нормальным (рисунок 3В). В частности, у футболистов - LL – 65%, SL- 27%, SS -8%, у синхронисток-  LL - 49%, SL- 35%, SS -16%, у хоккеистов : LL -49%, SL- 42%, SS -9%.  Таким образом, наблюдалось значительное преобладание LL генотипа среди спортсменов. Носители двух LL аллелей, проявляют меньший конформизм по сравнению с носителями других генотипов, менее сдержаны и более агрессивны и импульсивны, а также менее склонны к соблюдению социальных норм, чем носители S-аллели. Были выявлены некоторые тенденции в изменении частотного распределения аллелей в зависимости от роста квалификации: среди юных спортсменок (10-14 лет) успешными в основном являются носители LL-аллеля (80%) и носители SS- аллеля среди них совсем не встречается. Тем не менее, в более взрослой выборке (15-18 лет) распределение генотипов меняется. Среди мастеров спорта международного класса носители LL, LS и SS аллелей распределены равномерно. Более того, среди неуспешных синхронисток этой возрастной категории преобладают носители LL-аллеля (55%). Это, вероятно, можно объяснить тем, что носители LL-аллелей являются наиболее успешными в начале спортивной карьеры - агрессивность, импульсивность являются стимулирующими факторами для занятий спортом и поддержании хорошей спортивной формы. Однако во время приближения к спорту высших достижений большая импульсивность LL представителей, вероятно, начинает мешать, в то время как носители SS-аллеля, строго контролируя свои эмоции, медленно, но верно идут к намеченной цели.

Таким образом, учитывая генетическую индивидуальность спортсмена, можно: во-первых, оценить предрасположенность к неблагоприятным для конкретного вида спорта психоэмоциональным свойствам у начинающих спортсменов, во-вторых учитывать уникальную генетическую программу каждого спортсмена в разработке индивидуальной тренировочной программы и методов психологической коррекции и реабилитации постсоревновательный период.

 

1.3. Исследования полиморфизмов в гене 5-НТТ  в различных популяциях

Исследуемый контингент составляли лица мужского пола (93 человека) русской национальности в возрасте от 10 до 33 лет, обратившиеся за специализированной помощью в стационары г. Новосибирска в связи с употреблением опиодидов, каннабиноидов, летучих органических растворов, а также с психическими и поведенческими расстройствами, вызванными приемом психоактивных веществ группы опиоидов и каннабиноидов. Были исследованы полиморфизмы серотонинового транспортера (5-HTT, ID и VNTR). В контрольную группу был включен 41 человек — мужчины аналогичного возраста из общей популяции.

I/D HTT-гена не обнаружено, наблюдается тенденция к меньшей встречаемости в группе пациентов генотипа I/I по сравнению с контрольной. По частоте аллелей I и D, как видно из табл. 1, можно отметить некоторое повышение доли носителей аллеля I в группе контроля, а носителей генотипа D — среди наркотизирующихся (табл. 2).

Частоты генотипов и аллелей полиморфизма VNTR гена HTT у наркотизирующихся и в популяции мужчин г. Новосибирска

                                                         Таблица 1

Показатель

Наркоманы

Контроль

А

%

А

%;

Генотип 10/12

42

45,2

17

41,5

Генотип 10/10

18

19,4

5

12,2

Генотип 12/12

33

35,5

19

46,3

Аллель 10

78

41,9

27

32,9

Аллель 12

108

58,1

 

55

67,1

У лиц, склонных к использованию наркотических средств, более чем в половине случаев (61,3%) имело место носительство гетерозиготного генотипа I/D гена рецептора серотонина подкласса 5НТ2А (HTT ID), в трети случаев (29,0%) — гомозиготного генотипа I/I и реже (9,7%) — гомозиготного генотипа D/D, который отсутствует в контрольной группе. В группе контроля генотип I/D наблюдался со схожей частотой ((61,0 ± 7,6)%), а генотип I/I — в 39,0% случаев.                                                                                      

Носители генотипа 10/12 гена HTT среди основной группы представлены менее чем в половине случаев (45,2%), такая же частота носителей 10/12 и в контрольной группе (41,5%). Можно отметить, что среди употребляющих ПАВ носители генотипа 10/10 определялись несколько чаще (19,4 против 12,2% в контрольной), а генотипа 12/12 реже (35,5 против 46,3% в контрольной группе). Соотношение частоты аллелей 10 и 12 (см. табл. 1) аналогично распределению данных генотипов.

Как известно, серотонин участвует в регуляции сложных поведенческих реакций. Имеются доказательства участия серотонина мозга в регуляции потребления наркотиков. При изучении предрасположенности к нервно-психическим заболеваниям, в том числе к наркомании, особое внимание уделяется изучению генетического полиморфизма переносчика серотонина (ген 5- HTTLPR), выполняющего функцию обратного транспорта серотонина в пресинаптическое пространство. При изучении VNTR-полиморфизмов во 2-м интроне гена переносчика серотонина обнаружена ассоциация гомозиготных генотипов, в частности 10/10, с наркотизацией у мужчин. В ряде публикаций обнаружена и подтверждена ассоциация полиморфных маркеров гена 5-HTT (в основном маркера, локализованного в области промотора 5-HTTLPR) как с алкоголизмом, так и с наркоманией.

Среди наркотизирующихся сибирской популяции несколько чаще представлены носители генотипа 10/12, чем в контрольной группе. Генотип 10/10 встречается у лиц с употреблением ПАВ чаще, чем в контрольной группе. Среди наркотизирующихся больше носителей аллеля 10. Различия не достигают уровня статистической достоверности, возможно, из- за небольшого размера групп.

Рассматривая I/D-полиморфизм гена 5НТ2А, следует отметить, что у наркотизирующихся и в контрольной группе чаще представлен генотип I/D. Носители генотипа D/D присутствуют только среди лиц, употребляющих наркотические средства. В основной группе больше носителей генотипа D.

В основной группе генотип 10/10 гена 5НТ2А встречается чаще, чем в популяционной, что соответствует литературным данным. Среди наркотизирующихся и в контрольной группе высока доля носителей генотипа I/D гена 5НТ2А, генотип D/D встречается только у лиц, употребляющих наркотические вещества.

Ген серотонинового транспортера 5-HTT.

Характеристика групп. В исследуемую группу пожилых респондентов, состоящую из 245 человек (58 мужчин, 187 женщин), вошли пациенты Санкт-Петербургского городского гериатрического центра в возрасте от 60 лет до 101 года (средний возраст 79,75 ± 1,2 года). Группу популяционного контроля составили пациенты Покровского банка стволовых клеток в возрасте от 2 до 87 лет без выраженной патологии в анамнезе (163 респондента), в том числе, спортсмены от 13 до 53 лет (49 человек), образцы регистра пуповинной крови от 276 доноров, студенты С.-Петербургского государственного университета (112 человек) и пациенты Родильного дома №1 г. С.-Петербурга (40 женщин в возрасте от 18 до 46 лет).

При исследовании полиморфизма гена серотонинового транспортера 5-HTT у пожилых респондентов, у представителей популяции Северо-Запада РФ и при сравнении этих результатов с литературными данными, описывающими другие популяции, было показано, что частоты генотипов по гену 5-HTT (LL, LS, SS) практически не различаются во всех изученных группах стран Европы, но достоверно отличаются от таковых в Бразилии, Китае, Японии и у афроамериканцев США. Частоты генотипов по гену 5-HTT в разных популяциях и у пожилых приведены в табл 2.

Табл. 2.

Гендерных различий у пожилых респондентов Северо-Запада РФ в распределении частот генотипов по гену 5-HTT также выявлено не было. Повышение частоты генотипа SS у женщин (17,7%) по сравнению с мужчинами (14,3%) или частоты генотипа LS у мужчин (54,4%) по сравнению с женщинами (44,3%) статистически недостоверно (р > 0,05). Данные представлены на рис. 4 и 5.

Рис. 4. Гендерное распределение LL, LS и SS генотипов 5-HTT у пожилых респондентов

Рис. 5. Гендерное распределение аллелей L и S гена 5-HTT у пожилых респондентов

Рис. 6. Частота генотипа LL по гену 5-HTT в возрастных группах пожилых респондентов Северо-Запада России.

При сравнении частот генотипа LL в разных возрастных группах пожилых респондентов мы видим резкое увеличение частоты данного генотипа, часто выявляемого у спортсменов, среди мужчин возрастной группы 80-89 лет, как показано на рис. 6. Это говорит о том, что, как и при 13 изучении АСЕ и HTR2A, респонденты мужского пола достоверно чаще несут L вариант гена серотонинового транспортера. Впрочем, в самой старшей группе от 90 до 101 года мужчин-респондентов в данном исследовании не оказалось, что, к сожалению, не позволяет сделать более четкий и надежный вывод о роли генотипа LL в достижении активного долголетия.

Целью работы, проводившейся исследователями Томского государственного университета (Рядовая Л. А. и др.) явилось изучение полиморфизма генов серотонинового обмена у лиц с невротическими психическими расстройствами. Исследование проводили в группе психически здоровых лиц (85 человек, из них 68 женщин и 17 мужчин, средний возраст 38,8±13,8 лет), группе больных с расстройствами адаптации с преобладанием депрессивных реакций - Б43.20, Б43.21, Б43.22, МКБ-10 (69 пациентов, из них 60 женщин и 9 мужчин, средний возраст 43,27±11,7 года) и пациентов с диссоциативными (конверсионными) расстройствами - Б44, МКБ-10 (104 пациента, из которых 93 женщины и 11 мужчин, средний возраст 40,33±14,06 года). Все обследованные считали себя этнически русскими и не состояли в кровнородственных браках. Генетические исследования и создание банка ДНК проводились согласно этическим принципам медицинской генетики (протокол № 6 заседания Комитета по Биомедицинской этике ГУ НИИ ПЗ ТНЦ СО РАМН от 12.10.2005 г.). Исследование выполнено на базе лаборатории клеточных и молекулярно-биологических исследований и отделения пограничных состояний клиник ГУ НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН, лаборатории клинической генетики ГУ НЦ психического здоровья РАМН. В группе психически здоровых лиц и лиц с невротическими психическими расстройствами кровь для биологических исследований брали из локтевой вены. Выделение ДНК из венозной крови проводили стандартным методом с использованием протеиназы К и фенол-хлороформа . Высокомолекулярную ДНК высушивали при комнатной температуре и растворяли в ТЕ буфере, в таком виде ДНК хранили при -20°С. Для определения аллельного полиморфизма в локусе Т102С гена 5-НТT2А проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с помощью праймеров 5’-ТСТОСТАСААОТТСТООСТТ-3’ и 5’-СТОСАО СТТТТТСТСТАввв-3’, для анализа полиморфизма А-1438-в гена 5-НТT2А в реакционную смесь вносили праймеры с последовательностью нуклеотидов: 5’-ААОСТОСААООТАОСААСАОС-3’ и 5’-ААССАА  CTTATTTCCTACCAC-3’. Для выявления рестрикционного полиморфизма реакционную смесь обрабатывали ферментом Mspl в течение 12 ч при 37°С с последующим разделением полученных фрагментов в 3%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для определения полиморфизма в локусе VNTR-17 гена 5-HTT проводили ПЦР с использованием олигонуклео-тидных праймеров 5'-GTCAGTATCACAGGCTGCGAG-3' и 5'-TGTTCCTAGTCTTACGCCAGTG-3', полиморфизм в локусе 5'-HTTLPR гена 5-HTT выявляли с помощью праймеров 5'-GGCGTTGCCGCTCGTA ATGC-3' и 5'-GAGGGACTGAGCTGGACAACC-3'. Полученные VNTR-17 и 5'-HTTLPR ПЦР-фрагменты разделяли в 5%-ном полиакриламидном геле. Фрагменты визуализировали и идентифицировали в УФ свете при длине волны 495 нм. 

 

2. Материалы и методы исследования

 Выделение ДНК из периферической крови (человека и животных)

 Выделение ДНК фенолхлороформным методом

  1.  0,7-1 мл цельной крови соединить с буфером ТЕ (10 мМ трис и 1 мМ ЭДТА) до объема 1,5 мл в 1,5 мл полипропиленовой пробирке Эппендорф, перемешать.
  2. Далее центрифугировать на центрифуге К 23 при 350 g(8000 об/мин) в течение 10 мин.
  3. Супернатант осторожно удалить, осадок снова суспензировать в буфере ТЕ. Повторить процедуру 2-3 раза до полного удаления эритроцитов.
  4. Клеточный осадок суспензировать в 0,3 мл буфера ТЕ (20 мМ трис и 10 мМ ЭДТА), прибавить 10 мкл раствора протеиназы К (исходная концентрация раствора протеиназы К - 20 мг/мл, а рабочая концентрация -2 мг/мл) и 25 мкл 10% SDS(конечная концентрация 0,5 %); Общий объем смеси составляет 0,5 мл.
  1. Прибавить равный объем хлороформа (до полного удаления остатков фенола) и повторить стадии 7-8.
  2. К отобранной фракции добавить равный объем смеси фенола и хлороформа (до полного ингибирования РНК-азной активности). Повторить стадии 7-8.
  3. Перенести пипеткой прозрачный верхний водный слой в новую полипоопиленовую пробирку. Промежуточную и нижнюю органическую фазу отбросить.
  4. Центрифугировать 2 минуты в центрифуге Эппендорф (10000 об/мин) при комнатной температуре.
  5. Содержимое пробирки соединить с равным объемом фенола и размешать до образования эмульсии (фенол активно денатурирует белки, но не полностью ингибирует РНКазную активность).
  6. В термостате провести гидролиз при 60°С в течение 3 часов.
  7. К пробе добавить 128 мкл 8М ацетата аммония на 500 мкл смеси (конечная концентрация - 2 М) и осадить ДНК 100 % этанолом (в соотношении 1:2).
  8. Пробы охладить при -70°С в течение 30 мин для полного выпадения ДНК.
  9. Разморозить пробы и центрифугировать их на Эппендорфе (12000 об/мин) в течение 10 мин..
  10. Отобрать спирт пипеткой и добавить 80 % этанол - 1 мл; повторить процедуру 2 раза.
  11. Удалить спирт и добавить деионизированную воду - 200 мкл.

Выделение ДНК для ПНР из образцов крови набором «МИНИПРЕП»

  1. Внесите в пробирку 20 мкл буфера START.
  2. Добавьте 1 мкл образца крови. Перемешайте добавленный образец в буфере пипетированием или на вортексе.
  3. Добавьте 40 мкл лизирующего буфера. Тщательно перемешайте смесь пипетированием.
  4. Добавьте 4 мкл сорбента. Тщательно перемешайте смесь пипетированием. Оставьте пробирку при комнатной температуре на 10 мин.

Регулярно переворачивайте пробирку в течение этого времени каждые 2 мин. для предотвращения оседания сорбента.

  1. Поместите пробирку в магнитный штатив на 1 мин.
  2. Не вынимая пробирку из штатива, удалите супернатант.
  3. Промойте осадок сорбента в следующем порядке:

- 2 раза по 40 мкл буфером Wash

-1 раз по 40 мкл буфером Wash End

( каждый раз при отмывке тщательно встряхивайте осадок сорбента в промывающем растворе и затем помещайте в магнитный штатив на 15 сек.)

  1. После последней промывки просушите осадок сорбента на воздухе (или поместите в термостат при 37°С) в течении 10 мин.
  2. Добавьте 20 мкл буфера EL. Ресуспендируйте осадок пипетированием или аккуратны встряхиванием.
  3. Поместите пробирку для элюции на 55°С на 10 мин.
  4. Поместите пробирку в магнитный штатив на 1 мин. Не вынимая пробирки из штатива, отберите супернатант содержащий ДНК и перенесите его в новую пробирку.

Выделение ДНК методом «ДНК-экспресс-кровь»

  1. 0,7-1 мл цельной крови соединить с буфером ТЕ (10 мМ трис и 1 мМ ЭДТА) до объема 1,5 мл, перемешать на вортексе.
  2. Центрифугировать при 8 000 об/мин 10 мин.
  3. Супернатант удалить, к осадку добавить 1 мл буфера ТЕ.
  4. Перемешать на вортексе и центрифугировать при 8 000 об/мин 10

мин.

  1. Удалить супернатант.
  2. К осадку клеток прилить 200 мкл реагента «ДНК-экспресс-кровь».
  3. Содержимое пробирки тщательно встряхнуть на вортексе.
  4. Установить пробирку в предварительно прогретый до 98°С термостат на 15 мин
  5. Центрифугировать при 13000 об/мин 15 сек.
  6. Супернатант перенести в новую пробирку на 0,5 мл. Он и содержит раствор ДНК.

 

Растворы для выделения ДНК

  1. ТЕ буфер (10 мМ трис НС1 и 1мМ ЭДТА):

165 мкл конц.НС! довести до 100 мл дист.Н20 - 20 мМ НС 1

242 мг сухого триса довести до 100 мл дист.Н20 - 20мМ трис, 29,2мл(20мМ НС1) + 50мл(20мМ трис) +29,2мг (ЭДТА) доводим дист.Н20 до метки 100 мл.

  1. ТЕ буфер (20мМтрис НС1 и 10 мМЭДТА):

330 мкл конц.НС1 довести до 100 мл дист.Н20 - 40 мМ НС1, 484 мг сухого триса довести до 100 мл дист.Н20 - 40 мМ трис, 29,2 мл (40мМ НС 1) + 50мл (40мМ трис) +29-0 мг (ЭДТА) доводим дист.Н20 до метки 100 мл.

  1. 10%оДДС (SDS):

1г ДДС доводим до 10 мл дист.Н20.

  1. Раствор протеиназы К (20мг/мл):

20мг протеиназы К растворить в 1мл дист.Н20. (хранить при - 20°С).

  1. Раствор хлороформа:

Смешивают хлороформ с изоамиловым спиртом в соотношении

24:1.

  1. 8М ацетат аммония:

64,8г CH3COONH4 довести до 100мл дист.Н20.

Приготовление ТВЕ-буферов

  1. 5х ТВЕ (рН=8)

14,61 г сухого ЭДТА довести до 100 мл диет.водой и растворить при нагревании - 0,5 М ЭДТА.

54г сухого триса + 27,5г борной кислоты + 20 мл 0,5 М ЭДТА и довести до 1 л дист.водой.

  1. 1х ТВЕ буфер (pH=8)

Развести 5х ТВЕ буфер дист.водой в соотношении 1:4.

  1. 0,5х ТВЕ буфер (рН=8) Развести 1х ТВЕ буфер дист.водой в соотношении 1:1 или 5х ТВЕ в соотношении 1:9.

 

Проведение ПЦР для определения мутации в гене

  1.  Перед работой встряхните реактивы на вортексе, а затем отцентрифугируйте для осаждения капель.
  2. Скапайте ПЦР смесь из расчета, что на одну реакцию необходимо:

Н20 - 8,5 мкл, реакционная смесь - 10 мкл, MgCl2 - 1,5 мкл, праймеры - по мкл.

  1. Встряхните полученную смесь на вортексе и отцентрифугируйте для осаждения капель.
  2. Раскапайте по 23 мкл полученной ПЦР смеси в пробирки.
  3. Добавьте 2 мкл ДНК
  4. Встряхните полученную смесь на вортексе и отцентрифугируйте для осаждения капель.

Параметры циклов ПЦР:

  1. 95°С-120сек.
  2. 60°С - 50 сек. начало
  3. 95°С - 20 сек. конец Провести 38 циклов.

Электрофорез в ПААГе:

Приготовление геля (расчёт на две пластины)

Приготовить 0,5х ТВЕ буфер из 5х. Возьмите 8 мл 5х ТВЕ и поведите до 80 мл дистиллированной Н20.

К 18 мл 30% ПААГ прилейте 0,5х ТВЕ до объёма 90 мл.

К полученному раствору добавьте 500 мкл ПСА и 60 мкл Темеда. Размешайте, залейте гель в пластины.

Полимеризация идёт примерно 1 час.

Смешать 3 мкл утяжеляющего буфера с 17 мкл ДНК. На гель наносить по 20 мкл. Электрофорез провести при 200В 30 мин.

Окраска геля:

  1. Гель поместить в раствор бромистого этидия (0,5 мкг/мл) на 20

мин.

  1. Отмыть гель диет, водой в течение 20 мин.
  2. Наблюдать результаты на трансиллюминаторе.

Интерпретация результатов:

DD - фрагменты 113 и 37 п.н. Dd - фрагменты 150,113 и 37 п.н. dd -

фрагмент 150 п.н.

Электрофорез в агарозном геле:

Приготовление агарозных гелей

Все растворы для электрофореза готовят заранее.

  1. Для приготовления 0,8% (1,5) агарозного геля добавляют 0,8-1,5г агарозы 100мл буфера ТВЕ (1х).
  2. Нагревать смесь в кипящей водяной бане до полного растворения агарозы.
  3. Охладить раствор агарозы до 50-55° и добавить бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл (15мкл).
  4. Залить раствор в специальную электрофоретическую кювету и немедленно вставить на расстоянии примерно 1 см от одного из концов кюветы гребенку для формирования лунок. Высота гребенки подбирается таким образом, чтобы между ее зубьями и дном кюветы оставался зазор в 5-1 мм.
  5. Оставить камеру в строго горизонтальном положении до полного застывания геля при комнатной температуре 30-40 минут.
  6. Аккуратно вынуть гребенку и пометить кювету с гелем в электрофоретическую камеру
  7. Заполнить камеру таким количеством электрофоретического буфера ТВЕ (1х) чтобы он покрыл гель слоем, толщиной 1-Змм.

 

Определение концентрации ДНК:

  • Приготовить пробу анализируемой ДНК, для этого к 10 мкл раствора выделенной ДНК добавить 2 мкл шестикратного раствора для нанесения проб на гель.
  • Приготовить три разведения стандартного раствора ДНК ПААГ (25 мкг/мл) с содержанием ДНК 25, 50 и ЮОнг. Для этого к 1,2 и 4 мкл стандартного раствора ДНК добавить 9,8 и 6 мкл воды соответственно, и по мкл раствора для нанесения проб на гель.
  • Нанести пробы в лунки геля с помощью автоматической пипетки.
  • Провести электрофорез про 50 В/см до тех пор пока краситель не продвинется на 4-5 см.
  • Сформировать гель в коротковолновом УФ-свете.
  • Определить концентрацию ДНК в анализируемом препарате путем визуального сравнения интенсивности полос выделенной и стандартной ДНК.

Буферы и растворы:

  • Буфер ТВЕ (5х для электрофореза):

89 мМ трис, 89 мМ Н3В03, 2,5 мМ ЭДТА, р№=8,2.

Приготовление: растворить 54г триса, 27,5г борной кислоты в 800 мл воды. Добавить 20 мл 0,5М ЭДТА и довести объем до 1 л.

  • Растворы для нанесения проб на гель (утепляющий раствор)(6х): 30% глицерин (объем/объем), 0,25% бромфеноловый синий.

Для приготовления 20 мл: растворить 0,5г бромфенолового синего в 14 мл воды. Добавить к полученному раствору 6 мл глицерина и растворить.

  • Раствор бромистого этидия (10 мкг/мл):

Приготовление: 1г к 100мл воды размешивать на мешалке несколько часов до растворения. Хранят в темной посуде при 4°С. Берем 60 мл (концентрация 1 мкл/мл).

Примечание: бромистый этидий сильный мутаген, его взвешивание необходимо проводить под тягой, а при работе с его раствором - надевать перчатки.

  • Определение концентрации и чистоты нуклеинових кислот с помощью NanoDrop
  • открыть программу NanoDrop;
  • выбрать приложение Nucliic Acid;
  • промерить контроль( раствор, в котором элюированная ДНК). Поднять рычаг, поместить 1 мкл контроля на нижнюю измерительную подставку, опустить рычаг;
  • кнопка Blank;
  • промокнуть водой;
  • выбрать Туре (ДНК или РНК). В Sample IP записать номер;
  • взять 1 мкл образца, провести такие же действия как в п.З. Нажать кнопку Measure.

Сопс(конц) hg/ mL - нг/мкл

  • 260/280 - оценивание степени чистоты ДНК

Если показатель составляет около 1,8 - чистая ДНК, если он ниже свидетельствует о наличие примесей в растворе;

  • 260/230 - дополнительный критерий чистоты

Если показатель составляет от 1,8 до 2,2 - ДНК чистая, если же показатель ниже - присутствуют загрязнители.

 

Выводы

В ходе выполнения курсовой работы нами были изучены:

1. Структура гена 5-HTT, его строение, локализация в хромосоме. Было показано, что данный ген располагается в 17 хромосоме в локусе 17q11.2,

2. Основные полиморфные варианты и мутации в исследуемом гене.

По изученным данным можно сделать обобщение, что наличие полиморфизмов в гене 5-HTT, связанно с возникновением психических заболеваний и расстройств поведения.

3. Проведен анализ данных по частоте встречаемости полиморфизмов гена 5-HTT в различных популяциях. Были изучены основные полиморфные варианты и мутации в гене 5-HTT в популяциях Новосибирска, С-Петербурга и Томска.

По изученным данным можно сделать обобщение, что наличие полиморфизмов в гене 5-HTT, связанно с высоким риском развития психических заболеваний и расстройств поведения.

Именно в ходе этих сопоставлений и была прослежена особая роль гена 5-НТТ, влиявшего на работу серотониннергической системы

4. Нами отработаны несколько методик выделения ДНК из различного биологического материала, выделение ДНК с помощью метода обратной транскрипции. Приобретены навыки проведения полимеразной цепной реакции и электрофореза.

 

Литература

  1. Черепкова Е.В.1, Грибачева И.А. Исследование полиморфизмов ряда генов нейромедиаторной системы головного мозга и опиоидной рецепции у наркотизирующихся Бюллетень сибирской медицины, № 3 (2), 2009
  2. Анохина И.П., Иванец Н.Н., Шамакина И.Ю. и др. Современные проблемы генетики зависимости от психоактивных веществ // Наркология. 2004. № 6.
  3. Бочков Н.П., Асанов А.Ю., Аксенова М.Г. и др. Генетиче-ские факторы в этиологии и патогенезе наркоманий (обзор литературы) // Наркология. 2003. № 1.
  4. 4.Черепкова Е.В., Грибачева И.А. Исследование полиморфизмов ряда генов нейромедиаторной системы головного мозга…Бюллетень сибирской медицины, ¹ 3 (2), 2009
  5. Галеева А.Р., Гареева А.Э., Юрьев Е.Б., Хуснутдино- ва Э.К. Оценка VNTR-полиморфизма в генах переносчи-ков серотонина и дофамина у мужчин с опийной нарко-манией // Молекул. биология. 2002. Т. 36, № 4.
  6. Минко А.И., Линский И.В. Наркология. М., 2004.
  7. Халтурина Д.А., Коротаев А.В. Алкоголь и наркотики как важнейшие факторы демографического кризиса в России // Наркология. 2006. № 3
  8. www.bsmu.by/medicaljournal/c40d000024da525cc9b80a76332696c8/
  9. 9.Рядовая Л. А.Гормональный статус, генетический полиморфизм и мотивационно-пот. Диссертации на соискание ученой степени Томск – 2008
  10. URL: http://www.pynny.ru.
  11. Mckinnon D.   Genetic Determinants of Toxic Response in General Principles of Toxicology, Silbergeld, Ellen, Editor, Encyclopedia of Occupational Health and Safety, Jeanne Mager Stellman, Editor–in–Chief./ D. Mckinnon,  Ross, Nebert,W. Daniel  [Электронный ресурс]  International Labor Organization, Geneva.– © 2011.– 15р – Режим доступа: http://www.ilo.org/oshenc/part–iv/toxicology.
  12. Mckinnon D. Genetic Determinants of Toxic Response in General Principles of Toxicology, Silbergeld, Ellen, Editor, Encyclopedia of Occupational Health and Safety, Jeanne Mager Stellman, Editor–in–Chief./ Mckinnon, Ross, Nebert, W. Daniel  [Электронный ресурс]   International Labor Organization, Geneva. – © 2012. –9р – Режим доступа: http://www.ilo.org/oshenc.
  13. Gonzalez  A schematic pedigree of the development of some XMEs, especially the CYP2 family./ Gonzalez & Nebert, Nelson. – 1996.– 3р.
  14. Pirmohamed M. Genetic polymorphism of cytochrome P4502E1 and risk of alcoholic liver disease in Caucasians./ M. Pirmohamed, N. R. Kitteringham, L.J. Quest, R. L. Allott, V.J. Green, I. T. Gilmore, B. K. Park [Электронный ресурс]  Pharmacogenetics. – 1995.– Dec;5(6):351–7 – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Электронный адрес для связи admin@vseobiology.ru

© 2015-2017 https://vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Заказать курсовую

^ Наверх