Тема: Приготовление питательных сред для культивирования клеток и тканей in vitro

  • Вид работы: Реферат
  • Предмет: Культура клеток и тканей
  • Формат файла: MS Word

скачать реферат

 

Содержание

Введение

1. Виды питательных сред

2. Задачи и этапы размножения растений

3. Состав питательных сред и их приготовление

4. Этапы приготовления

5. Компоненты питательной среды

Заключение

Литература

 

Введение

Важным фактором, влияющим на успешность размножения того или иного вида растений, является питательная среда, которая должна содержать сбалансированный состав макро- и микроэлементов, углеводов, витаминов, регуляторов роста, аминокислот. Для успешного размножения in vitro в большинстве случаев прописи сред приходится подбирать индивидуально для каждого вида и даже сорта или культивара различных растений.

Некоторые среды содержат много компонентов, другие более просты. В прописи сред многие авторы включают вещества неопределенного состава: пептон, гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, картофельный экстракт, растительные соки, эндосперм кокосового ореха, гомогенат плодовбанана и т. д.

Успех клонального размножения во многом зависит от наличия и концентрации в среде тех или иных элементов минерального питания, органических соединений. Ошибки, допущенные при составлении прописей или в процессе непосредственного приготовления питательных растворов, во многих случаях очень наглядно проявляются на культивируемых растениях (формообразовательные процессы, ритмы развития).

Необходимо четко представлять, из какой климатической зоны происходит растение, знать его биологию и особенности размножения. Сегодня широко известен целый ряд готовых базовых питательных сред для всех этапов микроразмножения растений, однако предпочтительнее индивидуальное покомпонентное приготовление каждого типа питательной среды. Во-первых, это намного дешевле, во-вторых, позволяет своевременно и оперативно реагировать на изменения в поведении культуры in vitro.

1. Виды питательных сред

По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.

Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов. , для пролиферации новообразований и их роста удобнее использовать жидкие среды, прорастание семян и органогенез лучше происходят на твердых питательных средах.

Ткани, выращиваемые в жидких питательных средах, обычно культивируют в роллерах с круговым перемешиванием среды или в шейкерах вибрирующего типа, иногда используют стационарную среду, помещая ткань на мостики из фильтровальной бумаги.

Однако жидкая питательная среда не нашла широкого промышленного применения в силу ее некоторых недостатков.

Недостатком жидкой среды является то, что при помещении в такую среду эксплантов часто имеет место их гибель вследствие создания неблагоприятных для развития эксплантов анаэробных условий. Для предотвращения гибели обычно применяют мостики из фильтровальной бумаги, однако этот прием значительно снижает технологичность процесса микроразмножения, затрудняет посадку эксплантов, ведет к увеличению материальных и трудовых затрат. Кроме того, использование жидкой питательной среды часто приводит к витрификации тканей эксплантов и появлению сильно оводненных, "стекловидных" и маложизнеспособных побегов.

Вместе с тем известна питательная среда, в которую для затвердения вносят агар-агар в концентрации 6-8 г/л. Однако стоимость агара в настоящее время очень высока и его применение при культивировании пробирочных растений резко увеличивает себестоимость получаемого посадочного материала и снижает рентабельность производства. Кроме того, на указанной среде не всегда удается достичь высоких коэффициентов размножения.

Полужидкие и плотные питательные среды. Используют для учёта количества бактерий, выделения их в виде «чистой» культуры и других целей.  Необходимую консистенцию среде придают добавлением различных уплотнителей - агар-агар или желатину.

Агар-агар (малайское желе)- растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с ничтожным количеством азотистых веществ. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5-2%,полужидких -0,3-0,7%.

Желатина - кислый азотистосодержащий продукт, добываемый при выварке костей и хрящей. Обычно в питательные среды вносят 10-20% желатины. Но ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину, что делает его неудобным для применения.

 2. Задачи и этапы размножения растений

Химический состав среды, ее физические свойства должны соответствовать задачам, поставленным на данном этапе исследования. Основные задачи, которые решает исследователь при размножении растений в асептических условиях, можно сформулировать так: ввести в культуру, размножить (этап мультипликации), укоренить, высадить ex situ с последующей постасептической адаптацией. В соответствии с задачами процесс клонального размножения принято условно разделять на соответствующие этапы.

  1. На первом этапе часто в состав сред вводят антиоксиданты, предупреждающие активацию гидролитических ферментов и гибель высаженных эксплантов.
  2. На втором этапе состав среды преимущественно такой же, однако во многих случаях ее обогащают веществами, которые вызывают и многократно усиливают формообразовательные процессы, применяя увеличенные концентрации цитокининов.
  3. На третьем этапе подбирается состав среды, способствующий укоренению регенерантов; она или вообще не содержит фитогормонов, или содержит лишь небольшие количества ауксинов.

 3. Состав питательных сред  и их приготовление

Состав питательных сред является важным фактором, влияющим на рост и развитие растений in vitro. Кроме основных макроэлементов в состав большинства питательных сред входят также и микроэлементы; определенное их количество вносится вместе с макроэлементами. Для приготовления среды отмеривают нужное количество каждого солевого раствора, взвешивают соли железа, сахарозу, вносят те или иные добавки.

При необходимости питательные среды готовят на дистиллированной или бидистиллированной воде. Для удобства в работе и ускорения процесса целесообразно заранее приготовить растворы макро- и микроэлементов, соответственно в 10 и в 100 раз превышающие концентрацию рабочих растворов. Маточные растворы солей хранят в холодильнике при температуре 2-4°С в емкостях из темного стекла не более 6 недель.

Растворы регуляторов роста и витаминов обычно готовят из расчета 1 мг вещества на 1 мл раствора. Цитокинины (6-бензиламинопурин (БАП), зеатин, кинетин) сначала растворяют в не большом количестве 1 н щелочи, ауксины (ИУК, 1-нафтилуксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д)) – в 1 капле этанола и затем доводят до нужного объема бидистиллированной водой. Растворы витаминов и фитогормонов также хранят в холодильнике, однако для лучшей сохранности их можно разливать в емкости (эпендорфы) по 3-5 мл (для разового использования) и хранить в морозильной камере. Кинетин плохо растворим. С этой целью можно использовать различные растворители: 1 М раствор НС1 (несколько капель), 50%-й раствор этанола, диметилсульфат или 2%-й раствор NaOH. Гиббереллины растворяют в теплой дистиллированной воде. При этом следует помнить, что эти соединения термонестабильны.

Гумат натрия, гидролизат казеина, дрожжевой автолизат готовят в день их использования.

Агар лучше расплавить непосредственно перед употреблением в половинном объеме бидистиллированной воды, а затем добавлять к среде.

С учетом того что в растворах катионы простых неорганических солей железа, взаимодействуя с гидроксильными группами, могут выпадать в осадок (Fe203 • 3Н20) и плохо растворяются в средах, pH которых 5,0, железо в прописи питательных сред вводят в виде особых комплексных соединений — хелатов (NaFeЭДТА, FeЭДТА).

Приготовление растворов железа требует особенной тщательности. Раствор NaFeЭДТА готовится в следующей очередности: на аналитических весах взвешивают 5,57 г FeS0• 7Н20 и 7,45 г NaFeЭДТА. Далее в мерную колбу емкостью 1 л высыпают навески и объем доводят до метки. Раствор FeЭДТА готовят так: 26,1 г этилендиаминтетрауксусной (ЭДТА) кислоты нужно растворить в 268 мл 1 М раствора КОН, после чего добавить 24,9 г FeS04 х 7Н20 и довести объем дистиллированной водой до 1 л. Полученный раствор необходимо аэрировать в течение нескольких последующих часов с целью окисления (Grabowski et al., 1987).

Все манипуляции по приготовлению растворов удобно проводить с помощью магнитной мешалки. Дистиллированная вода должна быть теплой (37-40°С). Полученные таким образом маточные растворы являются комплексными соединениями железа, из которых по мере надобности берут необходимый объем, в зависимости от состава питательной среды. Растворы железа, как и все остальные растворы, должны храниться в холодильнике.

Наиболее часто используются среды с показателем pH от 4,3 до 6,0, т. е. в кислом диапазоне. Иногда, при длительном культивировании некоторых видов, со временем может произойти закисление культуральной среды, что негативно влияет на темпы роста. В этом случае необходимо проверить кислотность отработанной среды, и если сдвиг действительно произошел, то нужно чаще проводить пассажи.

Для коррекции кислотности используются 1 н растворы гидроксида натрия (NaOH) и соляной кислоты (НСl). Корректировку проводят перед автоклавированием во время активного перемешивания среды на магнитной мешалке, постоянно контролируя значения pH и при необходимости добавляя по каплям указанные выше растворы. Корректируя pH, нужно несколько завышать кислотность сред, так как во время автоклавирования происходит небольшой сдвиг pH в кислую сторону (~ на 0,5) вследствие образования сахарных кислот.

К любой питательной среде предъявляют ряд основных требований:

1). Стерильность и по возможности прозрачность.

2). При составлении питательных сред  учитывают потребность микроорганизмов в элементах питания (необходимые для жизнедеятельности клеток биохимические факторы - источники энергии, С, N, S, а также неорганические ионы - доступные для усвоения микроорганизмами).

3). Оптимальные значения ряда биофизических показателей: концентрации водородных ионов (pH), окислительно-восстановительного потенциала (Eh), активности воды (aw), осмотического давления.

 Этапы приготовления:

  1. варка: среды варят на открытом огне,водяной бане, автоклаве или варочных котлах.
  2. установление pH: ориентировочно производят с помощьюиндикаторной бумаги, для точного определения пользуются потенциометром или компаратором. При стерилизации pH снижается на 0,2, поэтому сначала готовят более щелочной раствор.
  3. осветлениепроизводят, если при варке среды мутнеют или темнеют. Для этого используют белок куриного яйца или сыворотку крови.
  4. фильтрацияжидких и расплавленных желатиновых сред производят через влажный бумажный или матерчатый фильтры. Фильтрация агаровых сред затруднена — они быстро застывают. Обычно их фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
  5. разливаютсреды не более чем на ¾ емкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.
  6. стерилизация: режим стерилизации зависит от состава среды и указан в её рецепте.
  7. контроль
  • для контролястерильности среды ставят на 2 суток в термостат, после чего их просматривают.
  • химическийконтроль окончательно устанавливает pH, содержание общего и амминого азота, пептона, хлоридов.
  • длябиологического контроля несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами, и по их росту судят о питательных свойствах среды.

5. Компоненты питательной среды

Компоненты питательной среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источник железа, витамины, источник углерода, регуляторы роста.

Основой всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимые соли К+, Na+, Са2+, Мg2+

Железо используется в виде хелатов (например, FeSO4·7H2O + этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)) – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.

В качестве источника углерода при выращивании гетеротрофных культур (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20–60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза) либо моносахариды (глюкоза, фруктоза, ксилоза и др.). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом или другими полисахаридами.

Для стимуляции биохимических реакций в культивируемых клетках используют витамины группы В (В1, В6, В12), С (аскорбиновая кислота), РР (никотиновая кислота), мезоинозит.  4 Для индукции каллусогенеза в состав питательных сред должны обязательно входить ауксины (вызывают клеточную дедифференцировку) и цитокинины (индуцируют деление дедифференцированных клеток). В случае индукции стеблевого морфогенеза содержание ауксинов может быть снижено или они могут быть полностью исключены. На средах без гормонов растут опухолевые и “привыкшие” ткани. Автономность по отношению к обоим классам экзогенных гормонов или к одному из них связана со способностью этих клеток продуцировать эндогенные гормоны.

В качестве ауксинов в питательных средах используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) в концентрациях 0,1-1,0 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК) – 0,1-2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) – 1-30 мг/л. Для индукции каллуса обычно необходимы высокие концентрации ауксинов (чаще это 2,4-Д), но при последующих пересадках их уменьшают.

В качестве цитокининов искусственные питательные среды могут содержать кинетин, бензиламинопурин (БАП), зеатин в концентрациях 0,001-10 мг/л. БАП и зеатин более активны по сравнению с кинетином в отношении поддержания роста изолированных тканей и индукции орга-ногенеза.

Кроме ауксинов и цитокининов, отдельные питательные среды включают гибберелловую кислоту (ГК). Присутствие ГК в среде не является обязательным, но в некоторых случаях она стимулирует рост изолированной ткани.

В качестве биологических добавок для получения первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10-15% от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – зеатин и его производные, а также соединения с цитокининовой активностью (NN-дифенилмочевина). Для культивирования растительных клеток и тканей in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6-6,0. Обычно к среде добавляют 0,7-0,8% агара. В качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели). Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др.  5

Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микро-соли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4оС.

Витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты лучше хранить при –20оС в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками. Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10-40 раз, микросолей – в 100-1000 раз, витаминов – в 1000 раз.

Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем смешивают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).

Маточный раствор хелата железа готовят и хранят отдельно от других солей. Неправильное приготовление хелатного железа может привести к выпадению в осадок после автоклавирования фосфатов кальция и магния.

Концентрированные растворы витаминов готовят каждый отдельно путем растворения соответствующих навесок в дистиллированной воде.

Фитогормоны, как правило, плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 10 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5-1 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5-1 н HCI или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 10 мл объема (1 мл содержит 1 мг гормона). В холодильнике их можно хранить при температуре 4єС не более 1 мес.

 Заключение

Для получения качественных, стабильных по составу питательных сред необходимо соблюдать в процессе их изготовления определенные условия.Среды должны изготовляться в точном соответствии с их рецептурой (качественно-количественном составом). При этом необходимо соблюдать и последовательность внесения компонентов, указанную в инструкции по их изготовлению. Отклонение от этого правила может привести к помутнению среды, образованию осадка.

Литература

  1. Т. И. Дитченко КУЛЬТУРА КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ
  2. РАСТЕНИЙ  МИНСК  2007 
  3. 2.findpatent.ru›patent/203/2039428.html
  4. 3.ru.wikipedia.org›wiki/

Электронный адрес для связи admin@vseobiology.ru

© 2015-2017 https://vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Заказать курсовую

^ Наверх