Методы исследования мембран

  1. Биохимические методы исследования биомембран позволяют выделять в максимально чистом виде отдельные компоненты различных мембран, изучать их физико-химические свойства, способность образовывать надмолекулярные лабильные комплексы, определять время “жизни” отдельных компонентов, путей биосинтеза и распада, влияние на метаболизм различных физико-химических факторов.
  2. Физиологические методы предусматривают исследование различных функций как на естественных, так и на искусственных. Физиологическими методами изучают:
  • проницаемость мембран для атомов, ионов, различных молекул;
  • процессы, протекающие в биомембранах при возбуждении, торможении, проведении нервного импульса;
  • поступление, распределение и выведение ионов и молекул из клеток и тканей,
  • влияние физико-химических факторов на состояние мембран и изменение физиологических функций клеток.
  1. Генетические методы, основанные на использовании мутантов, дефектных по синтезу определенных мембранных белков, позволяют решать вопросы о роли данных молекул белка в надмолекулярной организации, изменении функций мембран, их самоорганизации.
  2. Иммунологические методы предусматривают выделение определенных мембран, использование их как антигенов с целью последующего применения выработанных антигенов для идентификации специфических участков мембран, распределения антигенов на изучаемых участках мембраны, выделения комплексов антиген-антитело с последующим разделением на антиген и антитело.

К биофизическим методам исследования структуры и функций биологических мембран относят ряд высокоинформативных, хорошо зарекомендовавших себя методов, позволяющих получать достоверные сведения о состоянии молекул, молекулярных комплексов, целой мембраны и изменении их физико-химических параметров в зависимости от функционального состояния мембран. К биофизическим методам относят:

  • метод электронной микроскопии;
  • метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и использования спиновых меток;
  • метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР);
  • метод флуоресцентной спектроскопии (и использования флуоресцентных зондов);
  • метод определения дисперсии оптического вращения и кругового дихроизма;
  • метод дифференциальной сканирующей калориметрии;
  • метод рентгеновского рассеяния нейтронов;
  • метод моделирования;
  • метод искусственных мембран;
  • метод радиоактивных изотопов.

Просвечивающая электронная микроскопия тонких срезов миелина, а фактически и всех остальных мембран, выявляет характерную трехслойную структуру, состоящую из двух электроноплотных полос, разделенных промежутком около 80 А. Такая картина получается в значительной мере в результате обработки препаратов четырехокисью осмия, обычно применяемой в этом методе. Робертсон назвал наблюдаемую структуру "унитарной", чтобы подчеркнуть ее универсальность, и хотя молекулярные механизмы прокрашивания мембран осмием неизвестны, эта структура рассматривалась как подтверждение справедливости бислойной модели мембраны.

Некоторую информацию о расположении мембранных белков дали новые методы, ставшие теперь уже "классическими", - методы замораживания-скалывания и замораживания-травления. В этих случаях препараты быстро замораживают, не подвергая их при этом каким-либо повреждающим воздействиям, как при получении тонких срезов. Процесс подготовки препарата включает следующие операции.

После замораживания образец, представляющий собой суспензию клеток или мембран, скалывают с помощью ножа при низкой температуре в глубоком вакууме. Возникающие при скалывании усилия приводят к образованию среза, проходящего через образец. Оказалось, что, когда плоскость среза проходит через мембрану, последняя раскалывается преимущественно по своей срединной области и расщепляется на две половинки. В результате на образовавшихся плоскостях скола обнажается внутренняя область мембраны.

При необходимости образец подвергают травлению - проводят обычную возгонку льда в вакууме. Это позволяет лучше визуализировать поверхностные структуры клеточных мембран.

Большую информацию о структуре мембран, о взаимном расположении атомов мембранных молекул дает рентгеноструктурный анализ, основанный на дифракции коротковолновых рентгеновских лучей на атомах. Рентгеноструктурный анализ позволяет обнаруживать упорядоченность в расположении атомов и определять параметры упорядоченных структур (например, расстояния между кристаллографическими плоскостями). Исследования дифракции рентгеновских лучей подтвердили относительно упорядоченное расположение липидных молекул в мембране (было показано существование двойного молекулярного слоя с более или менее параллельно расположенными жирнокислотными хвостами), дали возможность точно определить расстояние между полярной головой липидной молекулы и метильной группой в конце углеводородной цепи.

К методам изучения динамики мембран, дающим возможность исследовать их, не разрушая, относятся флюоресцентный метод и методы радиоспектроскопии - электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Эти методы дают сведения о движении и взаимодействии мембранных молекул и отдельных частей молекулы. Было выяснено, что при физиологических условиях липидные молекулы находятся в жидком агрегатном состоянии. Метод ЭПР показал, что не вся поверхность биологической мембраны покрыта белками. Так, например, больше половины поверхности мембраны кишечной палочки образована полярными головами липидов.

Для изучения биологических объектов в настоящее время активно используется лазерная микроскопия. Лазерная рентгеновская микроскопия – разновидность рентгеноструктурного анализа, основанного на дифракции рентгеновских лучей на исследуемом объекте. В отличие от традиционного рентгеноструктурного анализа, исследуется одиночные молекулы и их сочетания. Данный вид микроскопии позволяет получать изображения с разрешением в несколько нанометров.

Конфокальная микроскопия – это один из методов оптической микроскопии. Отличительной особенностью данного метода является использование диафрагмы, способной отсекать поток фонового рассеянного света. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени происходит регистрация изображения одной токи объекта. Полноценное изображение получается за счет сканирования передвижения образца или перестройки оптической системы. После объективной линзы расположена диафрагма небольшого размера так, чтобы свет, испускаемый исследуемой точкой, проходил через нее и регистрировался, а свет, исходящий от других точек, задерживался диафрагмой.

Описанный метод исследования позволяет изучать внутреннюю структуру различных клеток. С его помощью можно идентифицировать отдельные молекулы и структуры клетки, микроорганизмы, а также динамические процессы, протекающие в клетках.

© 2015-2018 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Заказать курсовую

^ Наверх