Метод фиксации потенциала. Для изучения потенциалзависимых мембранных каналов применяется метод фиксации потенциала. В данном методе используют электронную систему с обратной связью, которая обеспечивает автоматическое поддержание мембранного потенциала. Разность потенциалов по разные стороны мембраны фиксируют на определенном уровне, при этом мембранный потенциал можно ступенчато изменят на строго определенную величину. Такой метод позволяет измерить ионные токи, протекающие сквозь мембрану через каналы, которые активируются при изменении потенциала. В соответствии с законом Ома, если напряжение на мембране постоянно, изменения тока однозначно связанные с изменениями проводимости. В свою очередь, можно фиксировать мембранный потенциал на разном уровне и измерять возникающие при этом токи. Если же использовать растворы с различенным ионным составом, и препараты, избирательно блокирующие тот или иной канал, то можно будет изучать поведение различных ионных каналов, через которые протекают измеряемые токи.

Технически фиксация потенциала осуществляется следующим образом. При помощи усилителя-регулятора внутриклеточный потенциал сравнивают с управляющим потенциалом. Любое отклонение мембранного потенциала от управляющего усиливается и на выходе усилителя возникает управляющий ток. Этот ток течет через электроды, расположенные по разные стороны мембраны в таком направлении, что мембранный потенциал вновь становится равным управляющему.  Такое автоматическое согласование происходит за долю миллисекунды после того, как задается ступенчатый управляющий потенциал. Когда в ответ на такую ступенчатую деполяризацию открываются натриевые (или какие-либо другие) каналы, соответствующие ионы входят в аксон по электрохимическому градиенту и переносят с собой электрические заряды. Эти входящие заряды стремятся сдвинуть мембранный потенциал в положительном направлении, однако малейшее отклонение от управляющего потенциала немедленно компенсируется в результате удаления из клеток избыточных зарядов с помощью усилителя-регулятора. При этом записывается тот ток, который подается усилителем для поддержания мембранного потенциала на необходимом уровне, и этот ток в точности равен ионному току, протекающему через мембрану.

Метод фиксации напряжения, или кламп метод, позволяет измерять ионный поток при перемещении иона по контролируемому градиенту электрохимического потенциала и получать информацию об электрической проводимости мембраны и её пассивной проницаемости в отношении интересующего нас иона. Этот метод используется для измерения вольт-амперных характеристик растительных клеток, что позволяет получить информацию о тонких механизмах функционирования различных систем мембранного транспорта.

Метод пэтч-кламп (позволяет осуществлять локальную (точечную) фиксацию мембранного потенциала и измерять токи через одиночные ионные каналы.  На данный момент этот метод является мощным средством для исследования биомембран. Метод позволяет:

  • проводить многие исследования в рамках классических электрофизиологических подходов.
  • регистрировать токи и потенциалы от клеток очень малых размеров (3-10 мкм)
  • регистрировать токи одиночных каналов амплитудой порядка пикоампер
  • исследовать действие лекарственных препаратов при быстром подведении их как к наружной, так и к внутренней стороне мембраны.

Метод пэтч-кламп был введен в исследовательскую практику Неером и Сакманом. Основой для создания метода послужило обнаружение факта, что при определённых условиях клеточная мембрана формирует очень плотный контакт с поверхностью кончика стеклянного микроэлектрода. При небольшом разрежении, создаваемом внутри пипетки, между стеклом и мембранным фрагментом возникает контакт, имеющий гигаомное сопротивление. В результате образуется электрически изолированный участок мембраны, и шум регистрирующего сигнала уменьшается на несколько порядков. Так как контакт мембраны со стеклом очень прочен, то находящийся под кончиком электрода фрагмент надо либо изолировать от клетки, либо разрушить, и таким образом проникнуть внутрь клетки.

Наиболее близким к естественным условиям является вариант измерения ионных токов на прикреплённой, но неповрежденной клетке. Измерение на целой клетке при разрушении мембраны в кончике микропипетки (whole-cell) позволяет заменять ионный состав цитоплазмы и изучать на диализированных таким образом клетках ионные токи в режиме фиксации напряжения. Ионные токи через небольшие мембранные фрагменты измеряют с помощью пипеток, у которых диаметр кончика соизмерим с размерами фрагментов. Сопротивление пипеток, заполненных раствором 150 ммоль/л KCl и погруженных в раствор такой же концентрации, приблизительно линейно зависит от площади отверстия кончика и варьирует от 1 до 5 МОм.

Метод перфузии клеток. Суть метода заключается в следующем. Исследуемый нейрон диаметром от 40 до 200 мкм помещается в конусообразную пору перегородки (1 = 200—300 и 2=25—80 мкм), разделяющей верхний и нижний отсеки экспериментальной камеры. Стены поры покрыты клейкой массой, изготовленной на основе вазелинового масла. В нижней камере создается отрицательное гидростатическое давление, обеспечивающее слипание мембраны клетки со стенками поры и частичное разрушение участка мембраны, контактирующего с нижним отсеком. Окончательное разрушение барьерных свойств этого участка достигается пропусканием через нижний отсек изоосмотического раствора соли калия, не содержащего кальция. После этого гидростатическое давление снимается. Верхний отсек камеры заполняется раствором Риигера. Контактирующий с ним рабочий участок клеточной мембраны полностью сохраняет возбудимость и генерирует полноценные потенциалы действия, которые отводятся электродами, находящимися в обоих отсеках камеры. 

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

^ Наверх