Существует три способа получения гена:
- выделение его из ДНК;
- путем химико-ферментативного синтеза;
- воссозданием на основе изолированной матричной РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы).
Выделение нужного гена из ДНК. Один из первых способов получения гена, который был предложен, — выделение ДНК из подходящего источника при помощи специфических ферментов — эндонуклеаз рестрикции, или рестриктаз. Этот метод обычно применяют в том случае, если структура ДНК, из которой выделяют нужный ген, хорошо известна, как и сайты рестрикции.
В общем виде схема эксперимента выглядит следующим образом. Вначале получают гомогенную ДНК, затем ее обрабатывают комплексом рестриктаз. Рестрикты встраивают в подходящую плазмиду (как правило, из серии pBRдля Е. coli), которую в свою очередь вводят в клетки-реципиенты, и исследуют просинтезированные белки. Отбирают те клетки, которые синтезируют нужный белок, а, следовательно, несут нужный ген. Описанный метод на первый взгляд кажется весьма простым и доступным. Однако у него существует ряд недостатков:
- обработка рестриктазой нативной ДНК может привести к расщеплению нужного гена или к отщеплению вместе с ним лишних участков этой кислоты, тогда полученные рестрикты не будут иметь никакой ценности,
- в выделенные таким способом гены нельзя встроить какие-то регуляторные элементы, поскольку неизвестна их структура и функциональная активность.
Химико-ферментативный синтез нужного гена. В качестве альтернативы вышеописанному методу был предложен второй метод — химико-ферментативный. Его сущность заключается в следующем. На первом этапе химическим синтезом получают короткие олигонуклеотиды, которые затем соединяют при помощи фермента лигазы. В результате получают нужный ген, не имеющий лишних участков, полностью соответствующий природному гену. Кроме того, в процессе синтеза в его структуру можно встроить необходимые регуляторные элементы, ввести какие-то замены и т. д. Однако описанный метод применим лишь в том случае, когда известна структура нужного гена или хотя бы структура кодируемого им белка. К недостаткам данного способа относится еще и трудоемкость.
Воссоздание нужного гена на основе изолированной матричной РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы). Это наиболее популярный метод синтеза генов. Матричной РНК обычно много в клетках, специализирующихся на синтезе определенного белка. Она не содержит интронов соответствующих генов, поэтому может транслироваться в бактериальной клетке. Обратная транскриптаза — РНК-зависимая ДНК-полимераза — образует копии ДНК с геномов мРНК.