27. Векторные молекулы ДНК. Требования, предъявляемые к векторам для клонирования. Плазмидные векторы.

В начале 50-х гг. XX в. было установлено, что типы спаривания клеток бактерий обусловлены генетически и, что генетическая информация переносится из клеток мужского типа в клетки женского типа, или реципиентные клетки. Их способность служить донорами передавалась при конъюгации чаще, чем любой другой генетический признак. Она получила название «F-фактор», или фактор фертильности (плодовитости). Он напоминал внехромосомные генетические элементы, имеющиеся в цитоплазме высших организмов, и в 1952 г. Ледерберг присвоил подобным системам общее название — плазмиды.

Итак, плазмиды — это автономные самореплицирующиеся генетические единицы (ДНК-содержащие), найденные у бактерий, грибов, растений и животных. Возможность их использования как векторов для введения чужеродных генов в бактериальные клетки начиная с 1975 г. послужила толчком для стремительного развития исследований в области генетической инженерии. На основе плазмидных векторов к настоящему времени сконструировано и клонировано большое разнообразие рекомбинантных ДНК, содержащих гены различных организмов — от самых примитивных до человека.

Наибольшее применение в генетической инженерии нашли бактериальные плазмиды, особенно образованные Е. coli. Так, последняя дает:

• ColEl,
• ColEl Amp (несет ген устойчивости к ампициллину),
• pBR322 (несет гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину).

Рассмотрим подробнее строение одной из этих плазмид, а именно плазмиды pBR322 которая была сконструирована в лаборатории Бойера.

Эта плазмида несет два селективных маркера, определяющих устойчивость к тетрациклину и ампициллину. Наиболее часто она используется для клонирования Pstl-фрагментов, хотя возможно ее применение для клонирования и других рестриктов.

При конструировании векторов на основе плазмид обычно учитываются три условия:

1. плазмида должна иметь ограниченное количество участков узнавания одной рестриктазой, под действием которой кольцевая молекула превращается в линейную. По границам данного разрыва происходит встраивание чужеродного сегмента ДНК. Чем больше плазмида содержит уникальных участков узнавания для различных рестриктаз, тем она универсальнее, т. е. допускает встраивать фрагменты, полученные рестриктазами различной специфичности;
2. вновь сконструированная рекомбинантная кольцевая ДНК должна сохранить репликативные свойства исходной плазмиды;
3. вектор должен иметь генетический маркер, позволяющий вести отбор рекомбинантных клонов.

В принципе методика клонирования в плазмидных векторах очень проста. ДНК плазмиды расщепляют рестриктирующей эндонуклеазой и соединяют in vitro с чужеродной ДНК. Затем получающимися рекомбинантными плазмидами трансформируют бактерии. Часто используют метод инактивации в результате вставки для тех плазмид, которые содержат несколько маркеров устойчивости к антибиотикам. Очищенную плазмидную ДНК и ту, которая должна быть встроена, расщепляют таким рестриктирующим ферментом, который узнает в плазмиде уникальный сайт, расположенный внутри гена устойчивости, например, к тетрациклину. Проводят лигирование этих двух ДНК в соответствующих концентрациях и лигированной смесью трансформируют, например, чувствительные к ампициллину клетки Е. coli так, что они становятся устойчивыми к этому антибиотику.