Завершающим этапом молекулярного клонирования является идентификация тех клеток-реципиентов, которые несут встроенный ген-мишень. Эффективность выбранного метода отбора определяет успех генно-инженерного проекта. Необходимо при этом учитывать, что не все клетки являются трансформированными и несут необходимый ген. Поэтому отбор обычно проводят в два этапа.

На первом этапе отбирают клетки, несущие соответствующий вектор, использованный для переноса генетической информации. Чаще всего клетки-реципиенты выделяют по тем маркерам, которые несет встроенный вектор. В случае применения в качестве вектора плазмиды pBR322, которая несет два гена устойчивости к антибиотикам, отбор трансформированных клеток можно вести на агаризованиой среде, содержащей ампициллин или тетрациклин, в которой эти клетки формируют колонии, и дальнейший отбор проводят уже среди них.

Помимо обнаружения клеток, трансформированных соответствующим вектором, существует необходимость отобрать среди них те, которые не только несут вектор, но и нужный ген — ген-мишень.

Поэтому по завершении первого этапа идентификации приступают ко второму, на котором используют две группы методов, описанных ниже. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов. Определение гена-мишени проводят двумя способами:

  • прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК (по методу Максама — Гилберта или по методу Сейгера);
  • гибридизационный анализ с соответствующей ДНК/РНК.

Методы, основанные на выявлении признака, кодируемого геном-мишенью:

  • иммунологическая детекция;
  • культивирование селективных питательных сред;
  • определение по продукту гена-мишени.

Прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК проводят, как уже было сказано выше, либо по методу Максама — Гилберта, либо по методу Сейгера. Их отличие заключается в следующем.

В первом используется принцип химической модификации нуклеотидных оснований ДНК с последующим выщеплением олигонуклеотида по модифицированному остатку. Полученный набор коротких олигонуклеотидов с различными концевыми основаниями и различной длины разделяют электрофоретически и идентифицируют при помощи радиоавтографии.

В методе, предложенном Сейгером, набор коротких нуклеотидов получают не химической модификацией, а при помощи ДНК-полимеразной реакции. При этом вместе с обычными нуклеотидами в синтезе используют терминирующие дидезоксирибо нуклеотиды.

Вторая рассматриваемая группа основана на идентификации признака, кодируемого геном, и включает следующие методы.

  1. Непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок (продукт встроенного гена). При этом идентифицируется белковый продукт, для чего используются иммунологические методы или методы определения его специфической активности.
  2. Отбор клеток, образующих соединение, в синтезе которого участвуют ферменты, кодируемые встроенным геном. Так, например, отбирали дрожжи, синтезирующие гистидин, из популяций клеток, трансформированных смесью химерных плазмид.
  3. Использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень. Например, если встроен ген Р-галактозидазы, то клетки можно отобрать на среде с лактозой.
  4. Иммунологическая детекция. Например, если в клетку встроен ген человеческого белка — интерферона, то трансформированные клетки можно отобрать при помощи антител к этому белку.

Для обнаружения антигенов в бактериях путем скрининга на основе специфического их взаимодействия с антителами часто используется метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого пластиковый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител и помещают его на предварительно лизированные колонии. Антигены из лизированных бактерий связываются с антителами на диске. Их положение определяют с помощью радиоавтографии.

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Заказать курсовую скидка 15%

^ Наверх