Завершающим этапом молекулярного клонирования является идентификация тех клеток-реципиентов, которые несут встроенный ген-мишень. Эффективность выбранного метода отбора определяет успех генно-инженерного проекта. Необходимо при этом учитывать, что не все клетки являются трансформированными и несут необходимый ген. Поэтому отбор обычно проводят в два этапа.
На первом этапе отбирают клетки, несущие соответствующий вектор, использованный для переноса генетической информации. Чаще всего клетки-реципиенты выделяют по тем маркерам, которые несет встроенный вектор. В случае применения в качестве вектора плазмиды pBR322, которая несет два гена устойчивости к антибиотикам, отбор трансформированных клеток можно вести на агаризованиой среде, содержащей ампициллин или тетрациклин, в которой эти клетки формируют колонии, и дальнейший отбор проводят уже среди них.
Помимо обнаружения клеток, трансформированных соответствующим вектором, существует необходимость отобрать среди них те, которые не только несут вектор, но и нужный ген — ген-мишень.
Поэтому по завершении первого этапа идентификации приступают ко второму, на котором используют две группы методов, описанных ниже. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов. Определение гена-мишени проводят двумя способами:
- прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК (по методу Максама — Гилберта или по методу Сейгера);
- гибридизационный анализ с соответствующей ДНК/РНК.
Методы, основанные на выявлении признака, кодируемого геном-мишенью:
- иммунологическая детекция;
- культивирование селективных питательных сред;
- определение по продукту гена-мишени.
Прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК проводят, как уже было сказано выше, либо по методу Максама — Гилберта, либо по методу Сейгера. Их отличие заключается в следующем.
В первом используется принцип химической модификации нуклеотидных оснований ДНК с последующим выщеплением олигонуклеотида по модифицированному остатку. Полученный набор коротких олигонуклеотидов с различными концевыми основаниями и различной длины разделяют электрофоретически и идентифицируют при помощи радиоавтографии.
В методе, предложенном Сейгером, набор коротких нуклеотидов получают не химической модификацией, а при помощи ДНК-полимеразной реакции. При этом вместе с обычными нуклеотидами в синтезе используют терминирующие дидезоксирибо нуклеотиды.
Вторая рассматриваемая группа основана на идентификации признака, кодируемого геном, и включает следующие методы.
- Непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок (продукт встроенного гена). При этом идентифицируется белковый продукт, для чего используются иммунологические методы или методы определения его специфической активности.
- Отбор клеток, образующих соединение, в синтезе которого участвуют ферменты, кодируемые встроенным геном. Так, например, отбирали дрожжи, синтезирующие гистидин, из популяций клеток, трансформированных смесью химерных плазмид.
- Использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень. Например, если встроен ген Р-галактозидазы, то клетки можно отобрать на среде с лактозой.
- Иммунологическая детекция. Например, если в клетку встроен ген человеческого белка — интерферона, то трансформированные клетки можно отобрать при помощи антител к этому белку.
Для обнаружения антигенов в бактериях путем скрининга на основе специфического их взаимодействия с антителами часто используется метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого пластиковый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител и помещают его на предварительно лизированные колонии. Антигены из лизированных бактерий связываются с антителами на диске. Их положение определяют с помощью радиоавтографии.