Непосредственное участие хлорофилла в процессе фотосинтеза считается доказанным. По современным взглядам, хлорофилл направляет энергию солнечного луча не на углекислый газ, а на воду. Происходит окисление воды, водород присоединяется к хлорофиллу, а затем уже восстанавливает углекислоту с образованием углеводов (фотоокисление).
Восстановление углекислоты происходит за счет водорода воды, образующегося при фотоокислении. Весьма вероятно, что водород активируется ферментом гидрогеназой. Схематически процесс карбоксилирования и восстановления карбоксильной группы водородом можно представить следующим образом:
RH + CO2 = RCOOH
RCOOH + 4H = RCH2OH + H2O
Если это представление о фотоокислении воды правильно, то ясно, что кислород, выделяемый при фотосинтезе, должен быть кислородом воды, а не углекислого газа. Оказывается, последнее положение можно доказать и экспериментально. Известно, что кислород воды и кислород углекислого газа отличаются по своему изотопному составу, т. е. по своему атомному весу. Как и большинство химических элементов, кислород имеет как бы несколько разновидностей — изотопов, отличающихся этим признаком.
В настоящее время доказано существование трех изотопов кислорода с атомными весами: 16 (O16); 17 (O17) и 18 (O18). O18 легче соединяется с углеродом, чем с водородом. Поэтому в составе молекул CO2 его больше, чем в молекулах воды. В молекулах воды находится наиболее легкий кислород O16. А. П. Виноградову удалось собрать 20 л кислорода, образовавшегося в процессе фотосинтеза у водного растения элодеи, и установить его атомный вес. Оказалось, что по изотопному составу кислород, выделенный в процессе фотосинтеза, соответствует кислороду воды, но не кислороду углекислого газа.
Другим прекрасным подтверждением этого положения являются работы Ван-Ниля с пурпурными и зелеными серобактериями. Долгое время оставалось непонятным, способны ли эти бактерии к фотосинтезу. На свету они развиваются явно лучше, чем в темноте, и содержат хлорофилл, маскируемый у пурпурных серобактерий красным пигментом бактериопурпурином. В то же время эти бактерии никогда не выделяют кислорода. Исходя из представлений о том, что луч солнца действует не на углекислый газ, а на воду, Ван-Ниль сделал допущение, что роль воды здесь играет сероводород. Разлагая сероводород, зеленые и пурпурные серобактерии откладывают его в виде серы, или же сера сразу же окисляется ими до серной кислоты. Проведенные им опыты вполне подтвердили теоретические расчеты и объяснили, почему исследователи не обнаруживали кислорода при изучении фотосинтеза у пурпурных серобактерий.
Восстановление углекислого газа не за счет воды, а за счет другого соединения, например, сероводорода, получило в отличие от фотосинтеза название фоторедукции.
Многочисленные исследования, посвященные анализу воздействия внешних и внутренних факторов на воздушное питание растений, породили новое направление - экологию фотосинтеза, основным содержанием которого стало изучение этого процесса в различных природных условиях. Это направление получило особенно широкую разработку в трудах советских физиологов.
В 1905 г. Ф. Блэкман и Г. Маттеи установили, что процесс фотосинтеза складывается из двух фаз: первая включает световые (фотохимические) реакции, не зависящие от температуры, вторая - темновые (химические) реакции, тесно связанные с температурным фактором. Обе фазы фотосинтеза тщательно исследовал немецкий биохимик О. Варбург (1919, 1920). Он показал, что темновые реакции фотосинтеза можно изменить действием различных температур. Применив прерывистое освещение, Варбург определил продолжительность обеих фаз.
Новые перспективы фотохимических исследований фотосинтеза открылись после опытов английского биохимика Р. Хилла (1937, 1939), в которых изолированные хлоропласты растертых листьев эффективно восстанавливали на свету хиноны и выделяли кислород. При этом в качестве водородного акцептора был использован не СО2, а железо-калиевый оксалат. Эта реакция, получившая название реакции Хилла, подтвердила выводы Ван-Ниля и Гаффрона о том, что процессы восстановления СО2 и выделения О2 независимы и их можно изучать каждый в отдельности. Кроме того, она опровергла мнение, будто изолированные выделенные из клетки хлоропласты не способны осуществлять фотосинтез. Позднее было установлено, что фотосинтезирующая способность зеленых пластид сохраняется в том случае, если их поместить в водную среду, содержащую всю совокупность ферментов зеленой клетки.
Метод меченых атомов позволил одновременно советским (А. П. Виноградов, Р. В. Тейс, 1941) и американским (С. Рубен с сотрудниками, 1941) исследователям окончательно доказать, что выделяемый при фотосинтезе растений кислород образуется не за счет С02 или других окислителей, как это имело место в реакции Хилла, а за счет фотолиза воды.
Новые методы исследования позволили выявить в процессе фотосинтеза три основные стадии:
- отщепление атомов водорода под действием света от молекулы воды с выделением молекул кислорода;
- перенос атомов водорода в ходе двух фотохимических реакций,
- использование тех же атомов водорода для превращения углекислоты в сахара (темновые реакции).
Из трех названных стадий фотосинтеза наименее изучена первая. Несколько полнее исследована вторая, на которой благодаря хлорофиллу, играющему роль фотокатализатора, происходит аккумуляция световой энергии. За этим основным фотохимическим процессом следует ряд вторичных, так называемых темновых реакций, в которых накопления энергии не происходит. Суть же совершающихся при этом окислительно-восстановительных реакций заключается в переносе атомов водорода или электрона, образующихся на первой стадии фотосинтеза, от одной молекулы к другой.
Представление о том, что вторая стадия фотосинтеза состоит из двух фотохимических реакций, связанных с возбуждением упомянутых выше двух пигментных систем, к настоящему времени получило серьезное экспериментальное обоснование и стало почти общепризнанным. Однако механизм этих реакций раскрыт пока еще неполностью. Известно, что энергия, накопленная второй системой, используется для образования аденозинтрифосфата (АТФ), а первая система за счет энергии света обеспечивает восстановительные синтезы водородом. В итоге взаимодействие двух фотохимических систем приводит к образованию АТФ, выделению кислорода и синтезу органических веществ из углекислого газа. Третья стадия фотосинтеза, или так называемый цикл углерода, изучена наиболее полно. Крупнейших успехов в этой области достигли американский биохимик М. Кальвин с сотрудником А. Бенсоном и др. В начале 50-х годов было показано, что первым стойким продуктом фотосинтеза является фосфоглицериновая кислота, а акцептором углекислого газа - рибулезодифосфат. В итоге Кальвин (Нобелевская премия, 1961) разработал схему превращения углерода в процессе фотосинтеза, основное содержание которой сводится к следующему. Рибулезодифосфат, присоединяя молекулу СО2, распадается на две молекулы фосфоглицериновой кислоты, а последняя подвергается восстановлению при участии АТФ и пиридиннуклеотидов. Дальнейшие сложные превращения приводят к образованию конечных продуктов (углеводов) и регенерации рибулезодифосфата, Эту стадию фотосинтеза называют также циклом Кальвина. В настоящее время изучены не только вещества, образующиеся на отдельных этапах данной стадии, но и ферментные системы, катализирующие различные реакции цикла.
Процесс образования АТФ при фотосинтезе в отличие от синтеза АТФ при дыхании (окислительное фосфорилирование) Л. Арнон (1954) назвал фотофосфорилированием. Было установлено, что использование АТФ в качестве "единой энергетической валюты" идет в основном по разным руслам. Образующийся при фотофосфорилировании АТФ используется в первую очередь в реакциях восстановления углекислого газа и только частично для вторичных синтезов. АТФ же, синтезируемый при дыхании, используется преимущественно для других процессов жизнедеятельности растений - поддержания физико-химического состояния клеточных структур, осмотических явлений, движения протоплазмы, синтеза различных сложных соединений и др. Примечательно, что источник для синтеза АТФ и при фотосинтезе, и при дыхании как в растительной, так и в животной клетке один и тот же.
Д. Арнон с сотрудниками, открывшие в 1954 г. процесс фотосинтетического фосфорилирования на изолированных хлоропластах, многое сделали для выяснения условий, необходимых для обеспечения более высокой эффективности преобразования световой энергии в энергию химических связей АТФ, и выявления особенностей этого процесса.