Взаимодействие антигена со специфическим антителом проявляется в организме образованием иммунных комплексов. Прочному взаимодействию АГ с АТ способствуют:
- количество детерминант в АГ,
- количественное соотношение,
- последовательность расположения концевых групп аминокислот в детерминанте,
- наличие в детерминанте ароматических аминокислот,
- аффинитет и авидность.
Аффинитет – это связь одного активного центра (Fab 1или Fab 2) и детерминанты. Авидность – это cвязь всех активных цетров с детерминантами. Аффинитетом и авидностью измеряется прочная взаимосвязь с поверхностными структурами АГ и АТ.
Реакции АТ с АГ протекают также в системе «in vitro»то есть «в пробирке» и имеют ряд типичных характеристик: потребность в электролитах, обратимость, двухфазность (фаза взаимодействия активного центра АТ и детерминант АГ –несколько секунд или минут; фаза проявления – визуально наблюдаемый эффект несколько минут или часов). При соприкосновении гидрофобных групп белков в воде наступает их взаимное притяжение.
Часто такие реакции называют серологическими, так как источником АТ служит сыворотка крови. В связи с высокой чувствительностью и специфичностью серологические реакции нашли широкое диагностическое применение. Серологические реакции применяют для двух целей:
- По известному АГ определяют в исследуемой сыворотке титр специфических к данному АГ антител. Титром сыворотки называют то ее максимальное разведение, которое еще дает положительную реакцию с соответствующим АГ.
- С помощью известного АТ, т.е. диагностической иммунной сыворотки, определяют наличие в исследуемом материале специфического антигена или осуществляют серологическую идентификацию выделенной чистой культуры возбудителя.
Все серологические реакции можно разделить на несколько групп:
- Реакции, протекающие с укрупнением частиц АГ в растворе электролита: реакция агглютинации в ее различных вариантах, реакция преципитации и ее различные модификации.
- Реакции, протекающие с участием комплемента: реакция связывания комплемента, иммунного гемолиза и их модификации.
- Реакции, протекающие с нейтрализацией антигена: реакции нейтрализации токсинов, вирусов, реакции торможения гемагглютинации.
- Реакции, протекающие с участием фагоцитоза: опсонофагоцитарная реакция и другие.
- Реакции иммунофлюоресценции в различных вариантах.
- Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы: ИФА, РИА.
Для серологических реакций могут быть использованы целые клетки (корпускулярные антигены), например, лимфоциты, плазмоциты, клетки, пораженные вирусами, и т.д. (РИФ, РИА, ИФА); бактериальные клетки (РА, РИФ, РИА, ИФА); а также растворимые компоненты (растворимые, молекулярные АГ) для реакции преципитации, нейтрализации, ИФА и других.
Корпускулярный АГ – это живые или убитые (инактивированные) клетки в изотонических или буферных растворах. При инактивации клеток пользуются методами, не вызывающими изменения специфичности и снижения иммуногенных свойств. Стандартные антигены из инактивированных патогенных микроорганизмов широко применяются в серологическом анализе при обнаружении антител в сыворотках людей и животных.
С помощью серологических реакций выявляют у исследуемых бактериальных клеток антигенный состав. Взвеси эритроцитов, лимфоцитов, опухолевых клеток в серологических реакциях используют для определения локализованных на их поверхностных мембранах АГ групп крови, СД–маркеров, трансплантационных, опухолеспецифических и других АГ, а также для обнаружения в сыворотках АТ к этим антигенам.v
Антигены выделяют и очищают фракционированием различными методами с использованием моноклональных антител.
Иммунная сыворотка (антисыворотка) представляет собой сыворотку крови, содержащую антитела к данному антигену.
Реакция преципитации– это агрегация антителами (преципитинами) растворимых (молекул) АГ (преципитиногенов), проявляющаяся в помутнении прозрачной жидкости, в появлении преципитата в виде осадка, кольца и т.д. Антиген для реакции преципитации обязательно должен быть в молекулярном виде. Механизм реакции преципитации аналогичен реакции агглютинации, т.е. по «теории решетки». Агглютинация — это склеивание и выпадение в осадок микроорганизмов или других клеток (корпускулярных антигенов) под действием специфических антител в присутствии электролитов.
Осаждение из раствора комплексов АГ – АТ происходит в диапазоне эквивалентных соотношений концентраций взаимодействующих молекул. В случае большого избытка одного из реагентов образуется растворимый комплекс АГ–АТ и феномен реакции не проявляется. Поскольку преципитиноген имеет ультрамикроскопическое строение и его концентрация в единице объема выше, чем АТ в таком же объеме сыворотки, то для осаждения более легких частичек АГ с образованием видимого преципитата необходимо значительно большее количество АТ. Поэтому диагностические преципитирующие сыворотки выпускают с высоким титром АТ. Реакцию преципитации можно проводить в жидкой и твердой среде.
В основе иммунологических методов лежат серологические реакции, для постановки которых используют сыворотку (serum), содержащую антитела (основаны на взаимодействии антигенов и антител) и клеточные реакции, базирующиеся на взаимодействии антигенов (аллергенов) с Т–клетками.
Иммуномикробиологические исследования – вид микробиологического экспресс–анализа по выявлению специфических антител и антигенов.
Процесс взаимодействия антигена и антитела в серологических реакциях протекает в две фазы:
- специфическая – фаза взаимодействия, в которой происходит комплементарное соединение активных центров антител (паратопов) и эпитопов антигена. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут;
- неспецифическая – фаза проявления, характеризуется внешними признаками образования иммунных комплексов. Эта фаза может развиваться от нескольких минут до нескольких часов.
Оптимальное специфическое взаимодействие антител с антигеном происходит в изотоническом растворе с рН, близким к нейтральному. Реакция антиген–антитело в системе in vitro может сопровождаться возникновением нескольких феноменов – агглютинации, преципитации, лизиса. Внешние проявления реакции зависят от физико–химических свойств антигена (размер частиц, физическое состояние), класса и вида антител (полные и неполные), а также условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, рН, температура).
Поливалентность антигенов и антител обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это происходит в соответствии с теорией образования сетей, согласно которой к образовавшемуся комплексу антиген–антитело последовательно присоединяются другие молекулы антител и антигена. В результате формируются сетевые структуры, которые превращаются в агрегаты, выпадающие в осадок. Характер и выраженность реакции зависят от количественного соотношения антигенов и антител. Наиболее интенсивно реакции проявляются в том случае, если реагенты находятся в эквивалентном соотношении.
Необходимое условие образование решетки (сетей) – наличие более трех антигенных детерминант на каждую молекулу антигена и по два активных центра на каждую молекулу антитела. Молекулы антигена являются узлами решетки, а молекулы антител – связующими звеньями. Область оптимальных соотношений (зона эквивалентности) концентраций антигена и антител, когда в надосадочной жидкости после образования осадка не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела.
Агрегаты, способные выпадать в осадок, образуются при соединении антигенов с полными антителами. Неполные антитела (моновалентные) не вызывают образования сетевых структур и крупных агрегатов. Для выявления таких антител используют специальные методы, основанные на использовании антиглобулинов (реакция Кумбса).
Серологические реакции, благодаря высокой специфичности и чувствительности, применяют для выявления и количественного определения антигенов и антител. Количество иммунореагентов в реакциях выражают титром – максимальным разведением сыворотки или антигена, при котором еще наблюдается реакция.
Серологические реакции в микробиологических и иммунологических лабораториях используют в двух целях:
- для сероидентификации микроорганизмов, токсинов, антигена вообще с помощью известного антитела (иммунной диагностической сыворотки),
- для серодиагностики – определения природы антитела в сыворотке крови больного при бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваниях с помощью известного антигена (диагностикума).