При помещении фрагмента ткани или органа растения на питательную среду соответствующего состава может происходить дедифференциация соматических клеток с образованием каллусной ткани.
Получение каллусной ткани из различных эксплантов: фрагментов стебля, корня, листа, лепестков, тычинок
Каллус, образованный в культуре незрелых зародышей ячменя (а, б) и пшеницы (в).
Первый этап дедифференциации клетки связан с ее вхождением в клеточный цикл, что происходит под действием фитогормонов - ауксинов и цитокининов. Три фазы роста клеток:
- деление,
- растяжение,
- дифференцировка (утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря способности к делению).
Для того чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла их дедифференцировка, т.е. клетки должны как бы возвратиться в меристематическое состояние. Размножение дедифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную связано с индукцией клеточного деления, способность к которому она потеряла в процессе дифференцировки. Если дедифференцировка специализированной клетки обуславливается индукцией деления под влиянием цитогормонов, то дедифференцировка делящейся меристематической клетки связана с остановкой делений, деспециализацией клетки и только после этого - с индукцией делений, приводящей к каллусообразованию. Одни цитокинины в среде (сердцевинной паренхимы табака) блокируют клеточный цикл, клетки только старятся, как и без гормонов, но не растут; а у семядолей подсолнечника в таких же условиях каллус образуется. Как правило, для индукции каллусной ткани необходимо присутствие двух гормонов: ауксинов (дедифференцировка и подготовка к делению) и цитокининов (пролиферация - деление).
Имеются данные, что не только ауксины и цитокинины вызывают деление клеток, приводящее к образованию каллуса, но и так называемые элиситоры - метаболические вещества, индуцирующие защитные системы растений. Элиситоры - это БАВ, дерепрессирующие гены и, как следствие, активирующие клеточные деления, сравнительно быструю дедифференцировку специализированных клеток, сопровождающуюся активацией белкового синтеза. Отмечено, что при повреждении растительных тканей продукты деградации клеточных стенок действуют как гормоны, которые распространяются по растению, связываются со специфическими рецепторами на клеточных мембранах и инициируют каскад защитных механизмов - такие молекулы называются эндогенными элиситорами. Эффект, вызываемый действием одних и тех же гормонов, может быть различным в зависимости от физиологической характеристики ткани-мишени.
Переход клетки in vitro из дифференцированного состояние к дедифференцировке и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов (эпигенной изменчивостью). Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом составе клеток. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в количестве белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа. У двудольных растений процесс репрессии и депрессии генов, лежащий в основе дифференцировки, происходит легче, чем у однодольных.
Каллус может образовываться не только на раневой поверхности экспланта, но и в результате пролиферации внутренних тканей. В этом случае он разрывает слой ткани и выходит на поверхность. Примером является каллусо- генез в культуре изолированного пыльника: гаплоидная микроспора, образовавшаяся в ходе мейоза при культивировании пыльника in vitro, уклоняется от нормального микроспорогенеза, повторно симметрично делится, дедифференцируется и превращается в каллусную.
Интересно проходят дедифференцировка и каллусогенез в апикальной меристеме стебля (ткани, состоящей из делящихся недифференцированных клеток):
- сразу после переноса на питательную среду прекращаются митозы, характерные для ткани in vivo,
- клетки дедифференцируются,
- увеличиваются в объеме,
- теряют форму, характерную для меристем,
- изменяется структура ядра и цитоплазмы,
- только после этого вновь начинается деление клеток, приводящее к образованию каллусной ткани.
В настоящее время возможно получить длительную пересадочную каллусную культуру из любых живых тканей интактного растения. Каллусогенез in vitro свойственен:
- покрытосеменным,
- голосеменным,
- папоротникам,
- мхам,
- печеночникам.
В культуре in vitro различные клетки переходят к дедифференцировке, теряют характерную для них структурную организацию и начинают делиться, образуя гетерогенный первичный каллус, который через 4—6 недель необходимо субкультивировать (переносить на свежую питательную среду). Масса транспланта - 60-100 мг ткани на 20-40 мл питательной среды. В ходе субкультивирования формируется штамм, имеющий индивидуальные генетические и физиологические особенности.