Культуру тканей растений в настоящее время выращивают главным образом двумя способами:
- поверхностным — на агаризованных питательных средах или различных гелеобразующих подложках,
- в жидкой питательной среде.
В жидкой питательной среде каллус легко распадается на отдельные агрегаты клеток и дает начало суспензионной культуре. Известны два способа культивирования тканей в жидкой питательной среде:
- накопительное,
- непрерывное.
Важный фактор создания эффективной биотехнологической системы — подбор питательной среды, обеспечивающей потребности культуры ткани продуцента в химических компонентах, необходимых для оптимального биосинтеза целевого продукта. Обязательными компонентами питательных сред служат:
- смеси минеральных солей (макро- и микроэлементов),
- фитогормоны, выступающие как факторы регуляции процессов клеточного деления и дифференциации,
- источник углерода вводится в состав среды в виде сахарозы.
Получение автотрофных культур тканей — пока задача будущего. При приготовлении питательных сред в качестве подложки используют агар-агар, образующий с водой гель. В последнее время в качестве подложки для культуры тканей растений испытывают и другие гелеобраующие вещества:
- силикагели,
- биогели,
- полиакриламидные гели,
- пенополиуретан и др.
В питательные среды для культуры тканей и клеток растений входят:
- минеральные соли (макро- и микроэлементы),
- источник углеродного питания (сахароза, глюкоза и др.),
- витамины,
- регуляторы роста (ауксины, цитокинины, гиббереллины, обычно в концентрации 10~6~10~5М),
- агар-агар (0,6-1,0 %).
Иногда включают комплексные органические добавки:
- эндосперм кокосового ореха (7-20 %) или злаков (10-15 %),
- березовый или томатный сок (5-20 %),
- экстракты из органов вегетирующих растений (0,1—1 %),
- солодовый экстракт (5-10 %),
- дрожжевой экстракт (0,1-0,2 %),
- гидролизат казеина (0,02-0,1 %),
- смесь аминокислот и др.
Начиная работать с новым объектом, исследователи модифицируют состав стандартных сред, особенно набор и концентрацию органических компонентов. В настоящее время наибольшее распространение получили следующие питательные среды.
- Среда Мурасиге и Скуга (МС) - наиболее универсальная, пригодна для растительных клеток многих видов, дает хорошие результаты при каллусообразовании у большинства растений, хорошо поддерживает неорганизованный каллусный рост и вызывает индукцию морфогенеза у двудольных.
- Среда Шенка и Хильдсбрандта используется для получения каллусной ткани из мезокотилей табака, сои, красных бобов, кукурузы и других культур.
- Среда Гамборга и Эвелега (В5) используется при культивировании клеток и тканей бобовых растений.
- Среда Уайта применяется для укоренения побегов и нормального роста стеблевой части после регенерации.
- Среда Нича - китайская среда N6 - используется для индукции андрогенеза в культуре пыльников и для индукции морфогенеза у злаков.
- Среда Као и Михайлюка применяется для культивирования единичных протопластов и клеток.
Питательная среда должна обязательно содержать регуляторы роста (ауксин и цитокинин). Без регуляторов роста каллус обычно не образуется (это происходит лишь в некоторых случаях, когда экспланты обогащены собственными фитогормонами). Иногда для образования каллусной ткани и ее роста достаточно одного ауксина, как, например, при использовании эксплантов, содержащих наряду с паренхимными клетками проводящие и камбиальные ткани. Вероятно, проводящие пучки являются источником ауксинов и цитокининов для окружающих паренхимных клеток. Часто для успешного культивирования следует применять более низкие концентрации регуляторов роста, чем при получении каллуса. Иногда через несколько субкультивирований у каллусных тканей может исчезать потребность в цитокининах, так как у них увеличивается способность к синтезу собственных цитокининов.
В качестве регуляторов роста при культивировании применяют следующие:
- ауксины — ИУК, 2,4-Д, индолилмасляную кислоту (ИМК), анафтилуксусную кислоту (ПУК) и др.;
- цитокинины - кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин, тидиазурон; гиббереллины — ГК3; АБК; брассинолид; этилен.
Иногда в питательную среду добавляют активированный уголь, поливи- нилиирролидон (5-10 г/л), различные антиоксиданты: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), восстановленный глутатион (4 -5 мг/л), дитиотрейтол (1-3 мг/л), ди- этилдитиокарбамат (2-5 мг/л).