Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, называют суспензионными культурами. Отдельные клетки или небольшие их группы должны выращиваться во взвешенном состоянии в специальной аппаратуре, которая обеспечивает их аэрацию и перемешивание.

Обычно клеточную суспензию получают на основе культуры каллусной ткани. Успех работы во многом зависит от того, насколько удачно была выбрана или подготовлена исходная линия. Она должна быть рыхлой, легко распадающейся на небольшие клеточные агрегаты и клетки. Если каллусная ткань плотная, то ее в течение нескольких пассажей культивируют на питательной среде с повышенной концентрацией ауксинов (особенно 2,4-Д) и низкой концентрацией цитокининов, часто исключая из среды соли Са2+ или обрабатывая трансплант пектиназой.

Для получения суспензионной культуры клеток берется наиболее жизнеспособная (пролиферирующая) каллусная ткань, которую помещают в колбу с жидкой питательной средой. Питательная среда берется такого же состава, как и для роста каллусной ткани (за исключением агара), но иногда с увеличением количества ауксинов и/или уменьшением количества цитокининов. Инициация суспензионной культуры требует примерно 2- 3 г свежей массы каллусной ткани на 60— 100 мл жидкой питательной среды. Если каллусная ткань недостаточно рыхлая, ее разделяют на кусочки размером 3-4 мм. Колбу с культурой ставят на платформу качалки (скорость перемешивания 100-150 об/мин) или используют установку роллерного типа (скорость вращения до 20 об/мин).

Важно отметить, что суспензионную культуру можно получить прямо из фрагмента органа растения (диски запасающей паренхимы корнеплодов моркови, петрушки, клубней картофеля и др.), однако такой путь более трудный и длительный. Клетки экспланта должны образовать первичный каллус, и только после этого каллусные клетки, смытые с поверхности в среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии.

Через 2-3 недели культивирования получают первичную суспензию растительных клеток; это результат трех процессов:

  1. распадения части каллусной ткани на клетки и клеточные агрегаты в момент внесения в жидкую питательную среду и дальнейшего их деления и роста;
  2. отделения клеток и клеточных агрегатов в период культивирования и дальнейшего их деления и роста;
  3. распадения разрастающихся клеточных афегатов на более мелкие агрегаты и клетки.

При первых субкультивированиях необходимо избавиться от крупных клеточных агрегатов. Операцию проводят в асептических условиях. Первичную суспензионную культуру переливают в цилиндр, при этом крупные клеточные агрегаты оседают на дно, мелкие агрегаты и отдельные клетки остаются в толще раствора (для субкультивирования берут верхнюю фракцию). Операцию следует проводить и при последующих субкультивированиях, до приобретения клеточной суспензии желаемых характеристик.

Таковыми являются:

  • высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе);
  • морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);
  • отсутствие трахеидоподобных элементов.

Чтобы избавиться от кусков каллусной ткани (остатков экспланта) и очень крупных клеточных агрегатов, часто первичную суспензию перед субкультивированием фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита. Фильтрование рекомендуется проводить и в нескольких последующих субкультивированиях до получения клеточной суспензии нужного качества. Следует иметь в виду, что степень агрегированности суспензии зависит не только от характеристик исходной линии, но и от условий культивирования.

При субкультивировании необходимо постоянно поддерживать:

  1. период субкультивирования;
  2. режим перемешивания;
  3. режим аэрации;
  4. количество и физиологическое состояние инокулюма.

Для разных культур существует минимальный объем инокулюма (пересадочной культуры), то есть варьирует его критическая концентрация, обеспечивающая клеточное размножения в субкультуре. Это зависит от того, что только начиная с определенного числа клеток в единице объема культуральной среды появляются необходимые свойства так называемого кондиционирующего фактора, или фактора кондиционирования. Механизм его действия не выяснен, однако известно, что он имеет химическую природу, термостабилен, включает низкомолекулярные вещества и не заменяется фитогормонами.

Подбор оптимального количества инокулюма и продолжительность субкультивирования являются одним из способов отбора быстрорастущих линий.

Рост суспензионной культуры клеток (также как и каллусной ткани) высших растений оценивают по следующим параметрам или критериям роста:

  • сырая и сухая масса;
  • индекс роста;
  • число клеток в единице объема;
  • жизнеспособность клеток.

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

^ Наверх