Для развития методов глубинного выращивания культур клеток высших растений большое значение имеют достижения микробиологии. Разработанные ею способы выращивания применяются и для глубинного культивирования растительных клеток. В настоящее время используют закрытые и открытые системы культивирования в виде периодического или различных вариантов проточного (непрерывного) выращивания.
Закрытая система периодического режима выращивания («накопительное выращивание»). Наиболее простой и распространенный способ выращивания клеток высших растений. Суть его в том, что определенный объем инокулюма помещают в константный объем питательной среды и до последующего субкультивирования система остается закрытой по всем параметрам, кроме газов.
Закрытая система проточного режима выращивания (система «закрытого» протока). Этот режим занимает промежуточное положение между периодическим и открытым проточным выращиванием. Сущность его состоит в том, что в систему периодически (например, один раз в неделю) подают свежую питательную среду, а старую удаляют в том же объеме. Клетки при этом остаются в системе в течение всего цикла выращивания. Такой способ позволяет проводить исследования при высоких плотностях клеточной биомассы.
Открытая система проточного выращивания (система открытого протока). В систему периодически или непрерывно поступает свежая питательная среда, при этом отбирается старая среда с клеточной массой (биомасса).
Различают два основных типа регуляции открытых проточных систем по принципу:
- турбидостата,
- хемостата.
Турбидостат - биореактор, в котором подачу свежей питательной среды и отбор суспензии производят после достижения клеточной популяцией определенной плотности. Биореактор автоматически регулирует плотность клеточной суспензии благодаря наличию светочувствительного устройства, которое измеряет оптическую плотность культуры. При увеличении плотности автоматически включается проток, то есть происходит слив культуральной среды и одновременно поступление свежей питательной среды. После достижения культурой заданной оптической плотности слив прекращается. В настоящее время турбидостат практически не используется в связи с гибелью части клеток суспензии при отводе их в оптическую систему.
Хемостат - биореактор, в который с определенной скоростью подается свежая питательная среда и с такой же скоростью отбирается суспензия клеток, т. е. скорость протока задает экспериментатор. При этом скорость роста клеточной массы зависит от скорости протока, поскольку питательная среда лимитируется по одному из факторов, необходимых для роста:
- фосфору,
- азоту
- или углеводу.
Здесь при фиксированной скорости разбавления поддерживается постоянная скорость деления и плотность клеток в культуре. Изменяя скорость протока, можно перевести культуру из одного стационарного состояния в другое, что можно видеть на основании отношения между размножением клеток и скоростью протока:
g=ln2/М,
где g - время генерации (период удвоения) клеточной популяции; М — удельная скорость роста, рассчитываемая по различным параметрам (критериям).
Скорость протока D (разбавление) рассчитывают по формуле D = S/V,
где S - проток, л/сут (объем питательной среды, поступившей в биореактор, равный количеству отобранной суспензии);
V - объем суспензии (культуральной жидкости) в биореакторе.
Например, если V= 10 л, a S - 1 л/сут, тогда D = 1/10 == 0,1 сут
Зависимость между скоростью роста и протоком выражается уравнением:
dx/dt=Mx-Dx
При использовании хемостата необходимо, чтобы скорость протока была равна максимальной удельной скорости роста клеточной популяции, т. е. D = М. В этом случае биомасса по всем критериям роста будет иметь константную величину - находиться в стабильном состоянии.
Если D M, величина биомассы падает (значения критериев роста уменьшаются).
Растительные клетки, в отличие от микробных, имеют специфические особенности:
- длительный период удвоения (сутки и более),
- несбалансированность роста по основным его критериям,
- наличие целлюлозно-пектиновой оболочки и вакуолизации, что придает им одновременно жесткость и хрупкость, и др.
Однако установлено, что глубинные культуры гетеротрофных клеток высших растений подчиняются тем же законам роста, что и микробные клетки.