Отдельные клетки (одиночные) культивируют для получения клонов, изучения их генетической и физиологической изменчивости или стабильности. Кроме того, культивирование отдельных клеток позволяет изучать условия, определяющие возникновение стимулов к делению у клеток, изолированных от влияния других клеток популяции или ткани. Отдельные клетки также важны для клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. Кроме того, отдельные клетки могут служить моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и изолированной клетке. Например, для изучения фотодыхания можно сравнивать процесс фотосинтеза на уровне отдельных клеток мезофилла листа и целой ткани.

При культивировании клеток вне организма проявляются генетическая изменчивость клеток, исчезновение одних и появление других стойких эпигенетических изменений, передающихся в ряду клеточных поколений, адаптивный отбор. Это приводит к формированию из первичной каллусной ткани генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Для выделения линий, маркированных по отдельным признакам, а также отбора мутантов и вариантов на селективных средах лучше использовать технику культивирования отдельных (одиночных) клеток.

Наилучшими источниками одиночных клеток могут быть клеточные суспензии и изолированные протопласты после восстановления клеточной стенки. Выращивание изолированных клеток складывается из двух этапов:

  • изолирование неповрежденной клетки растительной или каллусной ткани;
  • создание условий, благоприятных для роста и развития изолированной клетки.

Отдельные клетки можно легко выделить из суспензий с использованием:

  • микроманипулятора,
  • проточного цитофлюориметра с сортером.
  • путем последовательных разбавлений.

Наиболее простой является методика разбавлений:

  • из супер- натанта после оседания основной массы клеток отбирают 1-2 мл суспензии;
  • фильтруют ее через фильтры с уменьшающимся размером пор (нейлоновые сетки, металлические фильтры);
  • проводят последовательные разбавления с микроскопическим контролем клеточного состава.

Индукцию деления отдельных клеток осуществляют при использовании богатой питательной среды, например, Као-Михайлюка, с минимальным объемом. Впервые подобрать условия, подходящие для деления отдельных клеток, удалось в 1954 году Мьюиру, Хильденбранту и Райкеру. Этот способ получил название метода «ткани – няньки».

Схема использования каллуса в качестве «ткани - няньки»

Схема использования каллуса в качестве «ткани - няньки»

Ткани-«няньки» могут быть двух типов.

  • Тип I. Кусочки каллусной ткани того же или близкого вида располагают рядами на агаризованной среде в чашке Петри и на расстоянии 5 мм от каждого ряда помещают отдельные клетки. При этом взятый каллус должен находиться в состоянии активного роста, тогда каллусная культура играет роль «няньки», активируя деление и рост отдельных клеток.
  • Тип 2. На поверхность каллусной ткани через неделю после субкультивирования помещают фильтровальную бумагу, смоченную в жидкой питательной среде, а на нее - отдельную клетку. При этом важно поддерживать постоянную влажность, регулярно добавляя жидкую питательную среду в чашки Петри для смачивания фильтровальной бумаги. Такой тип культуры-«няньки», несмотря на сложность, достаточно эффективен - до 50 % высаженных клеток приступают к делению и образуют колонии, способные к субкультивированию.

Основу принципа «кормящего слоя» составляет суспензия клеток того же или близкого вида, что и одиночные клетки. Для этого суспензию клеток, находящуюся в ранней экспоненциальной фазе ростового цикла, облучают лучами в такой дозе, которая полностью ингибирует пролиферацию, но сохраняет большинство клеток живыми. Облученные клетки высевают с высокой плотностью (5-10) Т05 кл/мл на поверхность агаризованной среды, а затем на них помещают смесь суспензии клеток с расплавленной и остуженной до 35 °С агаризованной питательной средой. После помещения на такой «кормящий слой» отдельные клетки переходят к делению и образуют клеточный клон. Когда колония достигает величины 0,5—1,0 мм, ее переносят на свежую питательную срсду.

В основе использования ткани-«няньки» и «кормящего слоя» лежит действие фактора кондиционирования.

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Заказать курсовую

^ Наверх