Vinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.x

Отдельные клетки (одиночные) культивируют для получения клонов, изучения их генетической и физиологической изменчивости или стабильности. Кроме того, культивирование отдельных клеток позволяет изучать условия, определяющие возникновение стимулов к делению у клеток, изолированных от влияния других клеток популяции или ткани. Отдельные клетки также важны для клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. Кроме того, отдельные клетки могут служить моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и изолированной клетке. Например, для изучения фотодыхания можно сравнивать процесс фотосинтеза на уровне отдельных клеток мезофилла листа и целой ткани.

При культивировании клеток вне организма проявляются генетическая изменчивость клеток, исчезновение одних и появление других стойких эпигенетических изменений, передающихся в ряду клеточных поколений, адаптивный отбор. Это приводит к формированию из первичной каллусной ткани генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Для выделения линий, маркированных по отдельным признакам, а также отбора мутантов и вариантов на селективных средах лучше использовать технику культивирования отдельных (одиночных) клеток.

Наилучшими источниками одиночных клеток могут быть клеточные суспензии и изолированные протопласты после восстановления клеточной стенки. Выращивание изолированных клеток складывается из двух этапов:

  • изолирование неповрежденной клетки растительной или каллусной ткани;
  • создание условий, благоприятных для роста и развития изолированной клетки.

Отдельные клетки можно легко выделить из суспензий с использованием:

  • микроманипулятора,
  • проточного цитофлюориметра с сортером.
  • путем последовательных разбавлений.

Наиболее простой является методика разбавлений:

  • из супер- натанта после оседания основной массы клеток отбирают 1-2 мл суспензии;
  • фильтруют ее через фильтры с уменьшающимся размером пор (нейлоновые сетки, металлические фильтры);
  • проводят последовательные разбавления с микроскопическим контролем клеточного состава.

Индукцию деления отдельных клеток осуществляют при использовании богатой питательной среды, например, Као-Михайлюка, с минимальным объемом. Впервые подобрать условия, подходящие для деления отдельных клеток, удалось в 1954 году Мьюиру, Хильденбранту и Райкеру. Этот способ получил название метода «ткани – няньки».

Схема использования каллуса в качестве «ткани - няньки»

Схема использования каллуса в качестве «ткани - няньки»

Ткани-«няньки» могут быть двух типов.

  • Тип I. Кусочки каллусной ткани того же или близкого вида располагают рядами на агаризованной среде в чашке Петри и на расстоянии 5 мм от каждого ряда помещают отдельные клетки. При этом взятый каллус должен находиться в состоянии активного роста, тогда каллусная культура играет роль «няньки», активируя деление и рост отдельных клеток.
  • Тип 2. На поверхность каллусной ткани через неделю после субкультивирования помещают фильтровальную бумагу, смоченную в жидкой питательной среде, а на нее - отдельную клетку. При этом важно поддерживать постоянную влажность, регулярно добавляя жидкую питательную среду в чашки Петри для смачивания фильтровальной бумаги. Такой тип культуры-«няньки», несмотря на сложность, достаточно эффективен - до 50 % высаженных клеток приступают к делению и образуют колонии, способные к субкультивированию.

Основу принципа «кормящего слоя» составляет суспензия клеток того же или близкого вида, что и одиночные клетки. Для этого суспензию клеток, находящуюся в ранней экспоненциальной фазе ростового цикла, облучают лучами в такой дозе, которая полностью ингибирует пролиферацию, но сохраняет большинство клеток живыми. Облученные клетки высевают с высокой плотностью (5-10) Т05 кл/мл на поверхность агаризованной среды, а затем на них помещают смесь суспензии клеток с расплавленной и остуженной до 35 °С агаризованной питательной средой. После помещения на такой «кормящий слой» отдельные клетки переходят к делению и образуют клеточный клон. Когда колония достигает величины 0,5—1,0 мм, ее переносят на свежую питательную срсду.

В основе использования ткани-«няньки» и «кормящего слоя» лежит действие фактора кондиционирования.

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Электронный адрес для связи artemchichkov@gmail.com

^ Наверх