Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:
- небольшой выход протопластов;
- выделение их только из тканей, где происходит экстенсивный плазмолиз;
- трудность получения протопластов из меристематической или зрелой ткани;
- длительность и трудоемкость метода.
Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.
Преимущества энзиматического метода по сравнению с механическим:
- одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или клеток),
- клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу,
- клетки не повреждаются,
- метод сравнительно быстрый.
Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов:
- целлюлазы,
- гемицеллюлазы,
- пектиназы.
Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.
Выделение протопластов проводят в три этапа:
- обработка ферментами,
- выделение протопластов из клеточных стенок,
- отделение интактных протопластов от клеточных осколков.
Стандартная методика протопластов (по Такебе) из тканей листа Nicotiana tabacum:
Зрелый, сформировавшийся лист отделяют от взрослого растения в возрасте 60 - 80 дней, окунают в 70% этанол, а затем помещают на 15 - 20 минут в 10% раствор гипохлорита кальция и многократно промывают дистиллированной водой. С помощью пинцета нижний эпидермис снимают, очищенные от эпидермиса листья разрезают скальпелем на небольшие кусочки площадью 4 кв. см. Для лучшего снятия эпидермиса листья должны немного подвянуть, можно также ограничить снабжение водой перед срезанием листьев.
Далее ткань обрабатывают последовательно или одновременно пектиназой, вызывающей мацерацию, и целлюлазой, разрушающей клеточные стенки. Оптимальная концентрация ферментов, как и время обработки, индивидуальны для разных тканей. Протопласты должны находиться в растворе ферментов минимальное количество времени, после чего следует тщательная промывка. Ферменты стерилизуют через бактериальные фильтры.