Если мой сайт помог вам в подготовке к экзаменам вы можете отправить ссылку своим друзьям биологам.  Это сделает ресурс лучше!

Vinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.x

Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт "голый", один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки.

В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (маннит, сорбит, ксилоза, сахароза, глюкоза) или ионные осмотики (CaCl2, Na2HPO4 КС1). Концентрация стабилизатора обычно около 0,3-0,8 моль/л: осмотик должен быть слегка гипертоничным, чтобы протопласты были немного плазмолизированы (при этом тормозятся метаболизм и регенерация клеточной стенки). Так же эмпирически подбирают и другие условия среды:

  • интенсивность света (чаще используют темноту или слабый свет),
  • pH (обычно 5,4-6,2),
  • температуру,
  • концентрации солей (Ca2+, Mg2+, которые необходимы для стабилизации мембранной системы клетки).

Обрабатывать ткани ферментами удобнее в чашке Петри, которую держат под углом 15о. Смесь ферментов с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами:

  1. либо фильтрация с центрифугированием,
  2. либо флотация.

При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании оседают протопласты, осколки остаются в супернатанте. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования. Этот метод довольно грубый, так как разрушает хрупкие протопласты.

Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40 – 80 до 350 g. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста. В этот период клеточные стенки легче поддаются энзиматическому разрушению, а изолированные протопласты наиболее жизнеспособны. Увеличение в среде ауксина и снижение сахарозы за 1 сутки до выделения протопластов также активирует их выход.

Однако необходимо иметь в виду, что при использовании культуры клеток в качестве исходного материала при выделении протопластов всегда будет наблюдаться нестабильность числа хромосом: образуется смесь эуплоидных и анеуплоидных клеток (эуплоидные - клетки с числом хромосом, кратным X; анеуплоидные с числом хромосом, уклоняющимся от X и от чисел, кратных X). Последние неспособны к нормальному морфогенезу, поэтому снижается частота регенерации растений из изолированных протопластов.

Для стабилизации хромосом при использовании клеточных культур в качестве источника изолированных протопласт необходимо использовать некоторые особенности исходных объектов и условий культивирования:

  • выбор экспланта для культуры клеток: в тканях листа и молодых побегов диплоидных клеток больше, чем в сердцевидных клетках;
  • концентрацию регулятора роста: высокие концентрации кинетина способствуют возникновению полиплоидии;
  • поддержание условий, благоприятных для доминирования диплоидной популяции.

Протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28оС, невысокая освещенность (не более 2000 лк).

Давайте вместе сделаем данный сайт лучше! Поделитесь ссылкой на этот сайт со своими одногрупниками. Это поможет развитию нашего сайта.

2015-2021 © Биология для студентов | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

^ Наверх