Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт "голый", один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки.

В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (маннит, сорбит, ксилоза, сахароза, глюкоза) или ионные осмотики (CaCl2, Na2HPO4 КС1). Концентрация стабилизатора обычно около 0,3-0,8 моль/л: осмотик должен быть слегка гипертоничным, чтобы протопласты были немного плазмолизированы (при этом тормозятся метаболизм и регенерация клеточной стенки). Так же эмпирически подбирают и другие условия среды:

  • интенсивность света (чаще используют темноту или слабый свет),
  • pH (обычно 5,4-6,2),
  • температуру,
  • концентрации солей (Ca2+, Mg2+, которые необходимы для стабилизации мембранной системы клетки).

Обрабатывать ткани ферментами удобнее в чашке Петри, которую держат под углом 15о. Смесь ферментов с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами:

  1. либо фильтрация с центрифугированием,
  2. либо флотация.

При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании оседают протопласты, осколки остаются в супернатанте. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования. Этот метод довольно грубый, так как разрушает хрупкие протопласты.

Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40 – 80 до 350 g. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста. В этот период клеточные стенки легче поддаются энзиматическому разрушению, а изолированные протопласты наиболее жизнеспособны. Увеличение в среде ауксина и снижение сахарозы за 1 сутки до выделения протопластов также активирует их выход.

Однако необходимо иметь в виду, что при использовании культуры клеток в качестве исходного материала при выделении протопластов всегда будет наблюдаться нестабильность числа хромосом: образуется смесь эуплоидных и анеуплоидных клеток (эуплоидные - клетки с числом хромосом, кратным X; анеуплоидные с числом хромосом, уклоняющимся от X и от чисел, кратных X). Последние неспособны к нормальному морфогенезу, поэтому снижается частота регенерации растений из изолированных протопластов.

Для стабилизации хромосом при использовании клеточных культур в качестве источника изолированных протопласт необходимо использовать некоторые особенности исходных объектов и условий культивирования:

  • выбор экспланта для культуры клеток: в тканях листа и молодых побегов диплоидных клеток больше, чем в сердцевидных клетках;
  • концентрацию регулятора роста: высокие концентрации кинетина способствуют возникновению полиплоидии;
  • поддержание условий, благоприятных для доминирования диплоидной популяции.

Протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28оС, невысокая освещенность (не более 2000 лк).

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Заказать курсовую

^ Наверх