В настоящее время существуют два способа культивирования протопластов:
- метод жидких капель,
- метод платирования.
В первом методе суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. При этом обеспечиваются:
- хороший обмен газами через воздушную фазу,
- удаление в раствор (диффузия) экскретируемых продуктов,
- легкость добавления свежего питательного раствора.
Недостатки метода:
- изолированные протопласты агрегируются в центре капли, в результате образуя большое количество токсинов;
- нельзя получить индивидуальную колонию протопластов.
Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г.
Во втором методе- суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28оС. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта:
- формированием клеточной стенки,
- делением, ростом,
- развитием растения.
Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами, и они поддерживают и стимулируют их рост.
Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами.
На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора:
- видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения,
- способ и условия выделения протопластов,
- плотность высева протопластов,
- состав питательной среды.
Положительные стороны метода платирования:
- на одном протопласте можно наблюдать последовательность его развития, в том числе формирование клеточной стенки, деление клеток и т. д.,
- нет агрегации изолированных протопласт и накопления токсинов.
Недостатки метода: возможно повреждение протопластов при смешении с теплым агаром.
Вариант метода платирования - использование «кормящего слоя» или ткани-«няньки». Часто применяют метод совместных культур, когда объединяют изолированные протопласты с быстрым ростом и протопласты с трудным культивированием. При этом вещества, выделяемые быстрорастущими протопластами, активируют рост другой партии.