В настоящее время существуют два способа культивирования протопластов:

  1. метод жидких капель,
  2. метод платирования.

В первом методе суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. При этом обеспечиваются:

  • хороший обмен газами через воздушную фазу,
  • удаление в раствор (диффузия) экскретируемых продуктов,
  • легкость добавления свежего питательного раствора.

Недостатки метода:

  1. изолированные протопласты агрегируются в центре капли, в результате образуя большое количество токсинов;
  2. нельзя получить индивидуальную колонию протопластов.

Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г.

Во втором методе- суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28оС. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта:

  • формированием клеточной стенки,
  • делением, ростом,
  • развитием растения.

Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами, и они поддерживают и стимулируют их рост.

Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами.

На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора:

  1. видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения,
  2. способ и условия выделения протопластов,
  3. плотность высева протопластов,
  4. состав питательной среды.

Положительные стороны метода платирования:

  • на одном протопласте можно наблюдать последовательность его развития, в том числе формирование клеточной стенки, деление клеток и т. д.,
  • нет агрегации изолированных протопласт и накопления токсинов.

Недостатки метода: возможно повреждение протопластов при смешении с теплым агаром.

Вариант метода платирования - использование «кормящего слоя» или ткани-«няньки». Часто применяют метод совместных культур, когда объединяют изолированные протопласты с быстрым ростом и протопласты с трудным культивированием. При этом вещества, выделяемые быстрорастущими протопластами, активируют рост другой партии.

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Заказать курсовую

^ Наверх