Все работы по культивированию растительных объектов необходимо производить в асептических условиях. Если в состав питательной среды входят термолабильные вещества, их фильтруют через мембранные стерилизующие фильтры и добавляют в простерилизованную среду, охлажденную до 30-40 °С.

Изолированные фрагменты растения (экспланты), помещаемые на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами, поэтому их также необходимо стерилизовать. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают несколько раз водой очищенной. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ, несколько раз промывают водой и стерильным скальпелем удаляют наружные поврежденные слои клеток. 

В настоящее время изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах, которые отличаются по своему составу в зависимости от вида культуры. В состав всех питательных сред обязательно входят необходимые растению макроэлементы. Лучшей формой азотного питания являются нитраты (калия или аммония), в некоторых случаях дополнительно используются аминокислоты. Кроме азотистых соединений необходимы фосфор, сера, кальций, сульфаты. Отсутствие в питательной среде микроэлементов уже в первом пассаже (пересадке) может уменьшить интенсивность роста тканей на 30-40%, а при последующих - гибель тканей. В зависимости от вида изолированной культуры могут в небольших количествах использоваться: железо, бор, цинк, марганец, медь, алюминий, никель, йод и др.

Питательные среды для культивирования изолированных протопласт — такие же, как для культуры клеток;

  • МС,
  • В5,
  • Као-Михайлюка.

Однако необходимо создавать определенную буферную емкость среды, для чего применяют сопряженные пары солей — химически или физиологически кислые и щелочные соли, содержащие азот и фосфор. Например, в среде МС используют физиологически щелочную соль KNO3 и физиологически кислую соль NH4NO3, а также химически кислую соль КН3Р04 (pH среды поддерживается в пределах 5,6-5,8).

Питательные среды содержат также:

  • Fe-ЭДТА,
  • сахарозу,
  • витамины,
  • регуляторы роста.

Для стимуляции образования клеточной стенки добавляют углеводы, входящие в состав клеточной стенки (ксилозу, рибозу и др.). Для индукции деления изолированных протопласт добавляют регуляторы роста; 2,4-Д, нафтилуксусную кислоту (НУК), БАП, кинс- тин.

Температура культивирования протопластов зависит от вида растения, причем требования очень жесткие: изолированные протопласты не выдерживают даже незначительного отклонения от оптимальной температуры.

Интенсивность света также варьирует в зависимости от вида, но в общем высокая интенсивность губительно действует на свежевыделенные протопласты.

При низкой плотности засева протопласты не делятся, а при высокой на рост колонии влияют выделяемые продукты обмена. Считается, что оптимальная плотность ИП в куль туре - от 3-103 до 105 на 1 мл среды.

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Заказать курсовую

^ Наверх