27. Слияние протопластов (парасексуальная гибридизация)

Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов - своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая гибридизация. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки растений. Внеядерные генетические детерминанты у большинства высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и матерински. Техника парасексуальной гибридизации может позволить:

• скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов),
• получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого,
• слияние трех и более клеток,
• получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей,
• перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение,
• получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др.

Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков:

• скорость фотосинтеза,
• устойчивость к патогенам,
• абиотическим факторам и т. д.

Наличие косегрегация генов (признаки, контролирующие внеядерный геном, сегрегируют совместно) свидетельствует о физическом сцеплении генов.

Слияние протопластов бывает спонтанным и индуцированным. Первое происходит при одноступенчатом выделении протопластов, а также в изолированных протопластах, выделенных из молодых тканей или суспензионных культур. Оно осуществляется пассивно — путем расширения плазмодесм. Его частота и значение невелики.

Для индуцированного слияния изолированных протопластов с целью гибридизации соматических клеток используют такие методы:

1. добавление в среду инкубации веществ, стимулирующих слияние;
2. слияние с помощью электрического тока.

Рассмотрим первую группу методов. Начало индуцированному слиянию протопластов положили работы Е. Кокинга (1970): он продемонстрировал слияние изолированных протопласт из клеток меристемы корня томатов при добавлении в среду нитратов (главным образом NaN0₃). Однако частота слияний в сравнении со спонтанной увеличивалась не столь значительно.

Позже У. Келлер и Д. Мельхерс (1973) для индукции слияния предложили использовать высокие концентрации кальция (порядка 150 ммоль) при щелочном pH (например, для протопластов мезофилла). Однако изолированные протопласты из культуры клеток нечувствительны к такой обработке.

Наиболее эффективный химический стимулятор слияния протопластов- полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой от 1 540 до 6 ООО - предложен К. Као и М. Михашпоком (1974).

Методика слияния протопластов по К. Као. Она включает следующие этапы:

1. пастеровской пипеткой 0,1 мл суспензии протопластов переносят на покровное стекло, помещенное в чашку Петри;
2. через 5 мин после того как протопласты осядут на дно капли, осторожно добавляют маленькими каплями 0,45 мл 40%-го раствора ПЭГ-1540;
3. инкубируют при комнатной температуре 15-30 мин;
4. осторожно добавляют в течение 10 мин 0,5 мл питательной среды, в которой будут культивироваться протопласты;
5. промывают протопласты 5 раз с добавлением свежей питательной среды с пятиминутными интервалами между промывками, причем перед добавлением свежей порции на покровном стекле оставляют тонкий слой старой среды, чтобы не подсушить протопласты;
6. суспензию протопластов в среде культивирования переносят по 2 мл в чашки Петри;
7. протопласты смешивают с агаризованной питательной средой (температура 40 °С), которую разливают по 5 мл в чашку Петри.

Впоследствии этот метод объединили со способом слияния протопластов при высоком pH (10,5-11,0) и высокой концентрацией Са²⁺ (100-300 ммоль)

На первом этапе 28%-й ПЭГ вызывает агглютинацию изолированных протопласт, на втором но капле добавляли среду с высокими pH и содержанием Са²⁺, приводящую к слияниюю. Для улучшения слияния на втором этапе добавляли 2 % диметилсульфоксид. Число слившихся протопластов по такой методике возрастало до 50%. При этом наблюдали как гомо- и гетерологичные парные, так и групповые слияния. Многоядерные продукты слияния нескольких протопластов чаще всего нежизнеспособны, а гомологичные парные слияния не несут биологического смысла; таким образом, этот метод не позволяет добиться направленного слияния изолированных протопласт. Но этим способом были получены гибриды между протопластами растений и животных клетками, протопластами растений и водорослей.

В настоящее время все шире используется метод электрослияния изолированных протопласт, предложенный У. Циммерманом (1974). Он основан на применении неоднородного электрического поля, создаваемого переменным током напряжением 100- 300 В и частотой 1 МГц в камере, куда помещают протопласты и вводят платиновые электроды. В этих условиях наблюдается диэлектрофорез, и протопласты выстраиваются в цепочку между электродами. Для слияния используют сильный импульс постоянного тока 1,2 кВ/см в течение 50 мкс. Удельная электропроводность среды должна быть меньше 10⁴ См/см (например, 0,5 М раствор маннита имеет удельную электропроводность 1,4*10⁵ См/см). Метод постоянно модифицируется и улучшается.

Разработана модификация, позволяющая сливать предварительно отобранные пары протопластов партнеров. Капли с отобранной парой изолированных протопласт помещают на покровное стекло под слой масла; электроды прикреплены к конденсору инвертированного микроскопа. Поднимая или опуская конденсор, вводят или убирают электроды из капли, вызывая слияние протопластов.

К положительным моментам метода электрослияния можно отнести:

• контролируемость процесса,
• увеличение числа попарно слившихся и специально выбранных для этого протопластов.

Частота слияния протопластов при использовании метода электрослияния составляет 20 % и более.