Vinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.x

Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов - своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая гибридизация. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки растений. Внеядерные генетические детерминанты у большинства высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и матерински. Техника парасексуальной гибридизации может позволить:

  • скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов),
  • получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого,
  • слияние трех и более клеток,
  • получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей,
  • перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение,
  • получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др.

Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков:

  • скорость фотосинтеза,
  • устойчивость к патогенам,
  • абиотическим факторам и т. д.

Наличие косегрегация генов (признаки, контролирующие внеядерный геном, сегрегируют совместно) свидетельствует о физическом сцеплении генов.

Слияние протопластов бывает спонтанным и индуцированным. Первое происходит при одноступенчатом выделении протопластов, а также в изолированных протопластах, выделенных из молодых тканей или суспензионных культур. Оно осуществляется пассивно — путем расширения плазмодесм. Его частота и значение невелики.

Для индуцированного слияния изолированных протопластов с целью гибридизации соматических клеток используют такие методы:

  1. добавление в среду инкубации веществ, стимулирующих слияние;
  2. слияние с помощью электрического тока.

Рассмотрим первую группу методов. Начало индуцированному слиянию протопластов положили работы Е. Кокинга (1970): он продемонстрировал слияние изолированных протопласт из клеток меристемы корня томатов при добавлении в среду нитратов (главным образом NaN03). Однако частота слияний в сравнении со спонтанной увеличивалась не столь значительно.

Позже У. Келлер и Д. Мельхерс (1973) для индукции слияния предложили использовать высокие концентрации кальция (порядка 150 ммоль) при щелочном pH (например, для протопластов мезофилла). Однако изолированные протопласты из культуры клеток нечувствительны к такой обработке.

Наиболее эффективный химический стимулятор слияния протопластов- полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой от 1 540 до 6 ООО - предложен К. Као и М. Михашпоком (1974).

Методика слияния протопластов по К. Као. Она включает следующие этапы:

  1. пастеровской пипеткой 0,1 мл суспензии протопластов переносят на покровное стекло, помещенное в чашку Петри;
  2. через 5 мин после того как протопласты осядут на дно капли, осторожно добавляют маленькими каплями 0,45 мл 40%-го раствора ПЭГ-1540;
  3. инкубируют при комнатной температуре 15-30 мин;
  4. осторожно добавляют в течение 10 мин 0,5 мл питательной среды, в которой будут культивироваться протопласты;
  5. промывают протопласты 5 раз с добавлением свежей питательной среды с пятиминутными интервалами между промывками, причем перед добавлением свежей порции на покровном стекле оставляют тонкий слой старой среды, чтобы не подсушить протопласты;
  6. суспензию протопластов в среде культивирования переносят по 2 мл в чашки Петри;
  7. протопласты смешивают с агаризованной питательной средой (температура 40 °С), которую разливают по 5 мл в чашку Петри.

Впоследствии этот метод объединили со способом слияния протопластов при высоком pH (10,5-11,0) и высокой концентрацией Са2+ (100-300 ммоль)

На первом этапе 28%-й ПЭГ вызывает агглютинацию изолированных протопласт, на втором но капле добавляли среду с высокими pH и содержанием Са2+, приводящую к слияниюю. Для улучшения слияния на втором этапе добавляли 2 % диметилсульфоксид. Число слившихся протопластов по такой методике возрастало до 50%. При этом наблюдали как гомо- и гетерологичные парные, так и групповые слияния. Многоядерные продукты слияния нескольких протопластов чаще всего нежизнеспособны, а гомологичные парные слияния не несут биологического смысла; таким образом, этот метод не позволяет добиться направленного слияния изолированных протопласт. Но этим способом были получены гибриды между протопластами растений и животных клетками, протопластами растений и водорослей.

В настоящее время все шире используется метод электрослияния изолированных протопласт, предложенный У. Циммерманом (1974). Он основан на применении неоднородного электрического поля, создаваемого переменным током напряжением 100- 300 В и частотой 1 МГц в камере, куда помещают протопласты и вводят платиновые электроды. В этих условиях наблюдается диэлектрофорез, и протопласты выстраиваются в цепочку между электродами. Для слияния используют сильный импульс постоянного тока 1,2 кВ/см в течение 50 мкс. Удельная электропроводность среды должна быть меньше 104 См/см (например, 0,5 М раствор маннита имеет удельную электропроводность 1,4*105 См/см). Метод постоянно модифицируется и улучшается.

Разработана модификация, позволяющая сливать предварительно отобранные пары протопластов партнеров. Капли с отобранной парой изолированных протопласт помещают на покровное стекло под слой масла; электроды прикреплены к конденсору инвертированного микроскопа. Поднимая или опуская конденсор, вводят или убирают электроды из капли, вызывая слияние протопластов.

К положительным моментам метода электрослияния можно отнести:

  • контролируемость процесса,
  • увеличение числа попарно слившихся и специально выбранных для этого протопластов.

Частота слияния протопластов при использовании метода электрослияния составляет 20 % и более.

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Электронный адрес для связи artemchichkov@gmail.com

^ Наверх