Слияние протопластов состоит из двух частей:

  • адгезии,
  • собственно слияния мембран.

Адгезия наблюдается в растворах электролитического осмотика и практически не бывает при суспендировании протопластов в растворах неэлектролитического осмотика (маннит, сахароза) без добавления катионов. Поведение протопластов определяется электрокинетическими свойствами его поверхности - электрокинетическим потенциалом или поверхностным потенциалом .

Среды с высоким pH и высокой концентрацией Са2+ снижают электроки- нетический потенциал (за счет нейтрализации поверхностных зарядов протопластов); это ослабляет силы отталкивания поверхностных отрицательных зарядов протопластов, и происходит их агрегация.

Слияние протопластов

Схема и этапы слияния протопластов растений под действием полиэтиленгликоля (I) и электрического поля (II) (по Х. Борман, 1991).

При добавлении к популяции смешанных протопластов высокой концентрации ПЭГ (20-30 %) они слипаются в результате дегидратации, так как ПЭГ поглощает всю свободную воду между протопластами, вызывая разрывы в двойном слое мембраны. Он также снижает электрокинетичеекий потенциал, но агрегация под действием ПЭГ необратима.

Переменное неоднородное электрическое поле приводит к образованию в протопластах диполей (за счет неоднородности поля), а отрицательные заряды на поверхности изолированных протопласт в переменном поле нейтрализуются; в результате формируются агрегаты. Они могут образовывать скопления либо «мостики» между двумя электродами. Таким образом, во всех методах слияния протопластов на первом этапе возникает их агрегация за счет изменения электрических свойств поверхности.

Слияние мембран, происходящее вслед за адгезией протопластов, является результатом увеличения текучести; оно связано с фазовым разделением. Система Са2+ при высоком pH увеличивает текучесть мембран. ПЭГ не увеличивает текучесть, а слияние агрегатов происходит при отмывке от ПЭГ раствором с высоким pH и Са2+.

Метод электрослияния основан на индуцировании обратимого повреждения мембран. Изолированные протопласты предварительно суспендируют между двумя электродами. Применение переменного тока вызывает диэлектрофорез, и протопласты тем самым выстраиваются в ряд, примыкая полярными поверхностями один к другому. Согласно теории электромеханического сжатия, накладываемое электрическое поле сжимает мембрану, приводя к локальным разрывам при достижении порогового значения мембранного потенциала, приблизительно равного 1 В. Изменяющееся электрическое поле вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя области, свободные от белков, где противолежащие мембраны могут устанавливать контакт. Приложение сильного импульса постоянного тока (600 В/см в течение 10-20 мкс) ведет к образованию пор в сильно сжатых плазменных мембранах и формированию мостиков между двухслойными мембранами в точках контакта. Перетекание происходит в виде межпротопластного обмена. Переменный затухающий сигнал удерживает протопласты вместе, пока происходит смешивание цитоплазмы. При падении тока слившиеся протопласты возвращаются к своей сферической форме.

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

^ Наверх