Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами:
- физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т. д.);
- морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на разных этапах развития и т. д.).
Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами:
- культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой;
- завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца.
Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М.Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986).
Физиологическая, или прогамная, несовместимость партнеров при отдаленном скрещивании может зависеть от следующих причин:
- генетически детерминированное несоответствие рыльца пестика материнского растения и пыльцы отцовского (это тормозит рост пыльцевых трубок еще на рыльце пестика);
- гетеростилия (различия партнеров по длине столбика пестика и пыльцевой трубки);
- блокирование роста пыльцевой трубки на разных этапах ее пути от рыльца до микропиле семяпочки вследствие тканевой несовместимости.
Способ преодоления прогамной несовместимости - оплодотворение in vitro. Известны два основных варианта:
- материнское растение кастрируют за 2-3 дня до цветения, затем столбик пестика в асептических условиях укорачивают (или срезают полностью), а завязь помещают на питательную среду;
- семяпочками, готовыми к оплодотворению; в день цветения бутоны отцовского растения поверхностно стерилизуют, пыльники асептически извлекают, переносят в бокс или чашки Петри и подсушивают до состояния высыпания пыльцы. Пыльцу наносят на срез завязи (в первом варианте) или переносят на питательную среду вблизи плаценты с семяпочками или прямо на ткани плаценты (во втором варианте).
Оплодотворенные семяпочки быстро увеличиваются в размерах, в отличие от неоплодотворенных. Часто при плацентарном оплодотворении зародыш не переходит в состояние покоя и проростки появляются здесь же in vitro (гибридное растение). Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании N. tabacum х N. Rosulata и N. debneyi; с его помощью получены межвидовые гибриды табака.