Криосохранение – один из наиболее перспективных способов сохранения генофонда высших растений и животных. Оно позволяет хранить органы, ткани и клетки в замороженном состоянии при температуре жидкого азота (-196°С). Хранимый в этих условиях материал остается генетически стабильным и не подвержен изменениям, которые происходят с организмами при хранении обычными способами.

Развитие криобиологии (науки о действии низких температур на живые организмы) началось в 1900 году, когда К. Линде и Дж. Дьюар получили в значительных количествах жидкий воздух, состоящий из азота и водорода. Выдерживаемые в нём бактерии в дальнейшем не только оживали, но и сохраняли свои свойства.

Основными критическими моментами криосохранения являются образование льда внутри и вне клеток организма и их дегидратация (обезвоживание).

Образование внеклеточного и внутриклеточного льда заключается в том, что снижение температуры окружающей среды ниже точки замерзания раствора приводит к его переохлаждению, образованию льда вокруг клеток и возникновению центров кристаллизации. Вода выходит из клеток и замерзает на поверхности внешнего льда.

Образование внутриклеточного льда обычно повреждает клетки, и только в случае формирования очень мелких (стеклообразных) кристаллов льда они могут дальше развиваться.

Клетки растений являются более трудным объектом для криоконсервации, чем клетки животных. Это связано с их более крупными размерами: размер растительной клетки 15-1000 мкм, а размер клеток животных 7-25 мкм. Кроме того, растительные клетки содержат специальные органоиды – прочную целлюлозную стенку. Особенно осложняет обезвоживание наличие системы вакуолей. Центральная вакуоль в клетках растений может занимать до 90% от их общего объёма, что затрудняет их обезвоживание.

Технология криосохранения базируется на закономерности, что при криосохранении (криоконсервации) клетки переходят в состояние глубокого анабиоза и после длительного пребывания в нем возвращаются в обычное (нормальное) состояние.

Основные этапы криосохранения.

  1. Предварительное культивирование клеток или организмов. При этом учитывают устойчивость их к воздействию состава среды культивирования, а также соответствие возраста, стадии роста и количества клеток перед извлечением.
  2. Расфасовка подготовленного материала в контейнеры. При этом для замораживания и хранения подготовленных клеток или организмов используют разнообразные типы контейнеров. Расфасовку проводят в стерильных условиях.

Более совершенным методом хранения генофонда является криосохранение (в жидком азоте), где полностью прекращаются все метаболические процессы. Он гарантирует стабильное сохранение генетических характеристик объектов в течение практически любого срока. Его можно применять для сохранения генофонда широкого диапазона объектов - от изолированных протопластов до зародышей и семян.

В настоящее время метод замораживания и хранения разработан не более чем для 60 видов растений. Так, в криобанке Института физиологии растений РАИ хранятся в жидком азоте культивируемые клетки ряда линий и мутантов различных растений, в том числе уже более 20 лет культура моркови. Сотрудниками этого института совместно с ПИИ картофельного хозяйства разработаны методы криосохранения меристем многих сортов картофеля. В среднем из 20 % хранящихся меристем регенерируют растения, которые при высадке в поле по всем признакам не отличаются от обычных пробирочных растений.

Наиболее проста техника криосохранения пыльцы. Подсушенную пыльцу помещают в полиэтиленовые ампулы и прямо переносят в пеналы, находящиеся в сосуде Дьюара с жидким азотом. У 5 сортов картофеля пыльца, размороженная после 1, 2 и 3 лет хранения, имела высокую жизнеспособность, фертильность и была эффективно использована при скрещивании.

Более сложной является технология криосохранения культивируемых клеток, меристем, кончиков побегов, зародышей, так как необходимо защитить замораживаемые клетки и ткани от осмотического стресса и механического разрушения структур кристаллами льда, а также обеспечить жизнеспособность при опаивании и рекультивации. Глубокое замораживание - хранение - оттаивание являются экстремальным воздействием.

Технология включает следующие этапы:

  • подготовка культуры (специальное предварительное культивирование),
  • добавление криопротектора,
  • программное замораживание,
  • хранение в жидком азоте,
  • быстрое оттаивание,
  • удаление криопротектора,
  • рекультивирование и регенерация растений.

Криопротекторы - это вещества, которые при замораживании должны уменьшить повреждения клеток от осмотического и механического стрессов. Криопротекторами служат:

  • диметилсульфоксид,
  • глицерин,
  • поливинилпирролидон,
  • полиэтиленгликоль,
  • декстран и др.

Предобработка клеток осмотически активными веществами (маннитом, сорбитом, пролином и другими аминокислотами) также помогает защитить их от стрессов, повышая выживаемость после глубокого замораживания и оттаивания.

Режим замораживаиия на этапе от 0 до -40 °С может быть медленным (0,5-1,0 °С/мин) или сверхбыстрым (непосредственное погружение в жидкий азот объекта размером до 0,5 мм). При этом замораживание в медленном режиме дает более успешные результаты, но требует специального оборудования (программный замораживатель).

Оттаивание и восстановление роста культур часто представляет собой критический этап процесса. Для ряда видов разработаны свои методики, включающие определенную скорость, температуру и другие характеристики. Уже сейчас криобанки могут облегчить работу селекционеров, предоставив им возможность широко использовать пул генов сортов и диких видов. При этом можно сохранить без генетических изменений уникальные гибридные, мутантные и трансформированные линии.

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

^ Наверх