Весь процесс можно разделить на 4 этапа:
- Выбор растения –донора, изолирование и стерилизация экспланта, создание условий для его роста на питательной среде in vitro.
- Собственно микроразмножение, т.е. увеличение числа инициалей на экспланте и образование из них побегов с помощью:
- стимуляции развития всех пазушных почек экспланта вследствие подавления апикального доминирования;
- микрочеренкования побега, сохраняющего апикальное доминирование;
- индукции образования адвентивных почек тканями листа, стебля, чешуйками и донцем луковиц, корневищем, зачатками соцветий (без образования каллусной ткани);
- получения каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза или соматического эмбриогенеза.
- Укоренение размноженных растений и их адаптация к условиям in vivo.
- Выращивание растений (извлеченных из культуральных сосудов) в почве или искусственном субстрате (в условиях теплицы). Подготовка к реализации или высадке в поле. Верхушка побега проростка с гипокотилем
На 1 и 2 этапах КМР варьируют состав и сочетание регуляторов роста в питательной срсде. Проблемой здесь является ингибирование роста токсическими веществами, выделяемыми эксплантами в среду. Например, в результате травмы экспланта при его изолировании активируются фенолазы - ферменты, окисляющие фенолы; продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток экспланта. Для снятия подобных эффектов эксплант иногда отмывают в течение 4 24 ч дистиллированной водой или аскорбиновой кислотой (1 мг/л). Также в питательную среду рекомендуется добавлять антиоксиданты (аскорбиновую кислоту - 1 мг/л; глутатион - 4-8 мг/л; дитиотрейтол -3 мг/л; диэтилдитиокарбамат - 2-5 мг/л; поливинилпирролидон - 5000-10000 мг/л). Рекомендуется первые 4-5 дней держать культуры в темноте и только затем переносить на свет (освещенность 1—2 клк).
На 2 этапе должно быть быстрое размножение экспланта, а также трансплантов при длительном субкультивировании. Для этого подбирают оптимальные концентрации фитогормонов, причем каждый новый объект требует корректировки их количества.
На 3 этапе необходимо обеспечить развитие нормальной корневой системы, для чего обычно меняют основной состав среды (1/2 солей МС или среда Уайга), уменьшают количество сахара до 0,5-1,0 %, исключают цитокинины и увеличивают концентрацию ауксина до 1—2 мг/л. В некоторых случаях корнеобразование стимулируется добавлением к среде хлорогеновой или феруловой кислот (1-2 мг/л). Можно также обработать базальную часть побегов, извлеченных из пробирок, ауксинами (30-50 мг/л в течение 3-6 ч) и укоренять их без фитогормонов в агаризованной среде или другом субстрате; это дает больший процент укоренения, чем постоянное присутствие в среде ауксинов. Длительное время размножения на среде с цитокининами приводит к плохому укоренению. На данном этапе растения можно поместить на депонирование при пониженных температурах, что позволяет задерживать их развитие и таким образом сохранять длительное время, используя по мере надобности.
На 4 этапе проводят закалку растений, повышают их устойчивость к патогенным микроорганизмам и неблагоприятным факторам внешней среды, при этом увеличивают влажность воздуха, освещенность до 8-10 клк, подбирают оптимальный субстрат. Следует учитывать влияние фотопериода, спектрального состава света, температуры и газового состава атмосферы.