Живые организмы состоят из клеток, рост и деление которых нуждается в запрограммированных последовательных событиях и процессах, составляющих клеточный цикл. Некоторые из этих процессов происходят непрерывно, как, например, синтез белков и липидов. Другие, как, например, синтез ДНК, носят прерывистый характер и связаны с процессом клеточного деления.
В каждом клеточном цикле объединяются два динамических и качественно различных периода:
- интерфаза,
- митоз
Необходимо подчеркнуть, что процесс клеточного размножения основан на репликации ДНК, синтез которой происходит в периоде S интерфазы клеточного цикла. Интерфаза является наиболее длительным периодом клеточного цикла (90%), этот период представляет собой этап, когда клетка имеет интенсивную биосинтетическую активность (синтез ДНК, РНК, белков), обеспечивая необходимые условия для осуществления клеточного деления. Интерфаза подразделяется на три периода, известные как:
- Период G1 – пресинтетический или постмитотический период, во время которого: - возобновляется процесс транскрипции и белкового синтеза, блокированные во время митоза; - происходит деконденсация хроматина – важный процесс для активации транскрипции генов; - происходит реорганизация ядрышек; - клетка содержит диплоидный набор монохроматидных хромосом (2n = 2с).
- Период S – синтетический период, характеризуется: - полуконсервативной асинхронной репликацией молекул ДНК; - удвоением количества ДНК; - двухроматидными хромосомами (2n = 4с); - параллельным синтезом гистоновых и негистоно- вых белков, участвующих в синтезе и упаковке ДНК; - удвоением центриолей.
- Период G2 – постсинтетический или премитотический, в котором процессы транскрипции и белкового синтеза происходят с той же интенсивностью, что и в периоде G1, это обеспечивает необходимые условия для митоза.
Митоз и цитокинез. Клеточное деление начинается делением ядра (митоз) и завершается делением цитоплазмы (цитокинез). Митоз и цитокинез занимают короткий период клеточного цикла (10%) и носят название митотического периода. Митоз, однажды начавшись, представляет собой непрерывный процесс. Однако для изучения и описания его условно подразделяют на четыре этапа:
- профазу,
- метафазу,
- анафазу,
- телофазу.
Профаза характеризуется наличием в ядре двухроматидных хромосом. Эти хроматиды, соединенные на уровне центромеры, представляют собой цитологическую картину процесса репликации ДНК. Хромосомы сильно конденсируются, утолщаются и становятся видимыми; по обе стороны центромеры образуются по одному кинетохору. В конце профазы исчезает ядрышко и диссоциирует ядерная оболочка. Одновременно организуется аппарат деления: центриоли перемещаются к противоположным полюсам клетки, формируется веретено деления путем сборки микротрубочек.
Метафаза. Нити веретена деления связывают центриоль и хромосому с помощью кинетохоров. Хромосомы, соединенные с веретеном деления, располагаются в экваториальной плоскости, образуют метафазную пластинку. На этой стадии хромосомы максимально спирализованы и представляют собой оптимальную форму для цитологического изучения.
Анафаза начинается с продольного разделения центромеры каждой хромосомы, расхождения сестринских хроматид и завершается одновременной их миграцией к противоположным полюсам клетки. На этом этапе хромосомы становятся монохроматидными, и клетка содержит тетраплоидный набор хромосом (4n = 4с).
Телофаза. В телофазе заканчивается миграция хромосом к полюсам клетки, у каждого полюса содержится 2n монохроматидных хромосом (диплоидный набор). Начинается прогрессирующая деспирализация хромосом и возврат наследственного материала в состояние интерфазного хроматина. Нити веретена деления диссоциируют, вновь появляются ядерные мембраны вокруг каждой группы хромосом, вновь организуются ядрышки.
Цитокинез завершает процесс деления. Происходит разделение цитоплазматической массы на две половины и разделение клеточных органелл. Каждая дочерняя клетка наследует в результате цитокинеза набор клеточных компонентов. Увеличение количества всех компонентов клетки не требует точного контроля. Если в клетке имеется много молекул или органелл определенного типа, то достаточно того, чтобы число их приблизительно удвоилось за цикл, и они затем примерно поровну разделились между двумя дочерними клетками. Рост органелл происходит задолго до начала цитокинеза. Увеличение количества клеточных органелл реализуется различными путями. Митохондрии растут и делятся полуавтономно, аппарат Гольджи и ЭПС фрагментируются на пузырьки, которые служат для образования новых клеточных органелл, в то время как рибосомы размножаются путем образования комплекса рРНК и рибосомальных белков. В отношении ДНК такое удвоение и распределение должно быть совершенно точно, и для этого нужен специальный механизм: репликация ядерной ДНК. Этот механизм обеспечивает образование генетически идентичных клеток, как между собой, так и с материнской клеткой.
Митотическое деление является основой размножения соматических клеток, обеспечивает эмбриогенез, рост многоклеточного организма, определяет биомассу организма и регенерацию тканей.
В настоящее время цитометрию принято подразделять на:
- проточную,
- статическую.
Первый вариант цитометрии осуществляется с помощью специальных приборов – проточных цитометров и сортеров. Для статической цитометрии могут быть использованы конфокальные микроскопы, а также более простые и дешевые системы анализа изображений, смонтированные на обычных люминесцентных микроскопах.
Существует много методик, которые с одинаковым успехом можно воспроизводить как с помощью проточной, так и статической цитометрии. Более того, статическая цитометрия в некоторых случаях позволяет получить более обширную информацию о клетках, причем ее производительность ненамного меньше проточной.
Метод проточной цитометрии сформировался за последние 30 лет на основе отдельных опытов по подсчету числа частиц и определению их размеров.
В настоящее время выпускают два основных типа приборов для проточной цитометрии :
- простые в использовании аппараты, которые могут измерять флуоресценцию при двух и более длинах волн и светорассеяние под углом около 10º (малоугловое прямое рассеяние) и 90º;
- большие клеточные сортеры, которые не только измеряют пять и более клеточных или ядерных параметров, но и сортируют частицы с заданным набором этих параметров.
Принципы проточной цитометрии весьма просты. Клетки или ядра поодиночке пересекают сфокусированный световой пучок, обычно лазерный. Свет определенной длины возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценить сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают на компоненты. Световые сигналы детектируют, преобразуют в электрические импульсы и далее в форму, удобную для компьютерной обработки и хранения информации.
Методом проточной цитометрии можно получать самые разные данные:
- определять содержание в клетке ДНК и РНК, суммарное количество белков и количество специфических белков, узнаваемых моноклональными антителами,
- исследовать клеточный метаболизм (например, измерять внутриклеточный рН), изучать транспорт ионов кальция и кинетику ферментативных реакций.