Плазматическая мембрана, или плазмалемма, среди различных клеточных мембран занимает особое место. Это поверхностная периферическая структура, ограничивающая клетку снаружи, что обусловливает ее непосредственную связь с внеклеточной средой, а, следовательно, со всеми веществами и стимулами, воздействующими на клетку. Поэтому плазматическая мембрана играет роль барьера, преграды между сложно организованным внутриклеточным содержимым и внешней средой. В этом случае плазмалемма выполняет не только роль механического барьера, но, главное, ограничивает свободный поток низко- и высокомолекулярных веществ в обе стороны через мембрану. Более того, плазмалемма выступает как структура, «узнающая», рецептирующая, различные химические вещества и регулирующая избирательно транспорт этих веществ в клетку и из нее. Другими словами, плазматическая мембрана осуществляет функции, связанные с регулируемым избирательным трансмембранным транспортом веществ, и исполняет роль первичного клеточного анализатора.
Окружая клетку со всех сторон, плазматическая мембрана выполняет роль механического барьера. Эта механическая устойчивость плазматической мембраны может определяться дополнительными компонентами, такими как:
- гликокаликс,
- кортикальный слой цитоплазмы.
Гликокаликс представляет собой внешний по отношению к липопротеидной мембране слой, содержащий полисахаридные цепочки мембранных интегральных белков — гликопротеидов. Эти цепочки содержат такие углеводы, как манноза, глюкоза, N-ацетилглюкозамин, сиаловая кислота и др. Такие углеводные гетерополимеры образуют ветвящиеся цепочки, между которыми могут располагаться выделенные из клетки гликолипиды и протеогликаны. Слой гликокаликса сильно обводнен, имеет желеподобную консистенцию, что значительно снижает в этой зоне скорость диффузии различных веществ. Здесь же могут «застревать» выделенные клеткой гидролитические ферменты, участвующие во внеклеточном расщеплении полимеров (внеклеточное пищеварение) до мономерных молекул, которые затем транспортируются в цитоплазму через плазматическую мембрану.
Кортикальный (от слова cortex - кора, кожица) слой цитоплазмы, тесно контактирующий с липопротеидной наружной мембраной, имеет ряд особенностей. Здесь в толщине 0,1-0,5 мкм отсутствуют рибосомы и мембранные пузырьки, но в большом количестве встречаются фибриллярные элементы цитоплазмы — микрофиламенты и часто микротрубочки. Основным фибриллярным компонентом кортикального слоя является сеть актиновых микрофибрилл.
Электронная микроскопия. Исторически первой была просвечивающая электронная микроскопия тонких срезов мембран, которая позволила при окраске препаратов четырехокисью осмия выявить характерную трехслойную структуру мембран: на снимках четко видны две темные полосы с промежутком между ними шириной около 8 нм. При такой подготовке мембраны подвергаются, однако, 5 неблагоприятным воздействиям (в частности, обработка четырехокисью осмия приводит к значительной потере белка), и начались поиски более щадящей техники обработки срезов. Удачным решением оказался метод негативного контраста, когда препарат окрашивали молибденовокислым аммонием, который вообще не связывался с мембранным материалом, но заполнял пустоты между структурами, и таким образом не только сама липидная мембрана, но и расположенные на ней белки давали более прозрачное изображение на темном фоне поглощения молибдата – тяжелый атом молибдена давал боле сильное рассеяние электронов, чем легкие атомы органических молекул, входящих в состав мембран.
Следующим революционным шагом была разработка метода расщепления мембран при низкой температуре и приготовления реплик со сколов. В российской литературе эти методы иногда называются методами «замораживание– скалывание» и «замораживание–травление». Препараты быстро замораживают жидким азотом, затем образец скалывают при помощи ножа при низкой температуре (–100ºС) в глубоком вакууме. Мембрана раскалывается преимущественно по липидной зоне (где нет льда, механически прочного при низких температурах). В результате на поверхностях скола обнажается внутренняя область мембраны. После чего производят напыление металла (обычно платины) на образовавшуюся поверхность и тем самым получают реплику с этой поверхности. На платиновый слой для прочности наносят слой углерода. После этого препарат оттаивают, реплика всплывает и ее снимают при помощи специальной сетки. Подученную пленку и исследуют под электронным микроскопом.
Дифракция рентгеновских лучей (рентгеноструктурный анализ) Некоторые специализированные мембранные системы имеют регулярную структуру, поэтому их можно изучать методами рентгеноструктурного анализа. Примером является миелиновая оболочка периферических нервных волокон. Она представляет собой мембрану, которая, многократно оборачиваясь вокруг аксона, формирует регулярную систему из концентрических мембранных структур. Миелин исследовали еще в 30-х годах и получили данные по распределению электронной плотности в мембране, подтверждающие адекватность бислойной модели. Полученные данные свидетельствуют о том, что структура всех мембран сходна: они имеют внутреннюю область с низкой электронной плотностью и два слоя полярных группировок с высокой электронной плотностью.
Ядерный магнитный резонанс Метод ЯМР основан на наличии у многих ядер собственного магнитного момента. Ядра 1 H, 13C, 31P представляют для биологов и медиков наибольший интерес, поскольку резонанс этих ядер наиболее важен для определения структуры органических молекул. Метод ЯМР во многом основан на тех же принципах, что и ЭПР, но только обнаруживаются этим методом не электроны, а ядра атомов, обладающие механическим моментом PN и магнитным моментом µN. В соответствии с классическим представлением, предполагается, что атомные ядра, имеющие сферическую форму, вращаются вокруг оси. Величина механического момента вычисляется по уравнению. 2 N h P I π = (0.1) где h — постоянная Планка, I — спиновое квантовое число, обычно просто называемое ядерным спином. Применение метода ЯМР в органическом анализе и, в частности, в медико-биологических исследованиях огромно. Многое дало и использование этого метода при изучении молекул, входящих в структуру биологических мембран. Это относится, прежде всего, к применению самого распространенного варианта ЯМР, основанного на ядерном магнитном резонансе протонов (протонный магнитный резонанс или ПМР). С помощью ПМР высокого разрешения с Фурье-преобразованием проводятся исследования структуры белков.
Применяются и другие методы изучения структуры белков и липидов в мембранах и ее изменений при функционировании мембран или под влиянием различных воздействий. К таким методам относится ИК-спектроскопия и метод комбинационного рассеяния, электронный парамагнитный и ядерный магнитный резонанс, флуоресцентные метки и зонды, измерения светорассеяния и другие.