К наиболее важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК относят следующие:

• специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами, что ускоряет выделение различных генов и манипуляции с ними;
• быстрое секвенирование (установление последовательностей азотистых оснований в ДНК) всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида;
• гибридизацию нуклеиновых кислот, позволяющую с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания;
• клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК-фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий;
• генетическую инженерию, позволяющую получать модифицированные версии генов и затем внедрять их в клетки или организмы.

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами – рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Все ферменты можно условно разделить на следующие группы:

• используемые для получения фрагментов ДНК;
• синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК;
• соединяющие фрагменты ДНК;
• позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК;
• применяемые для приготовления гибридизационных проб.
   

Участки узнавания ДНК тремя рестриктазами из Haemophilus parainfluenzae (HpaI); Escherichia coli (EcoRI) и Haemophilus influenzae (HindIII)

Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней последовательность из 4…6 нуклеотидов. В настоящее время выпускается более 100 разнообразных рестриктаз. Каждый фермент опознает различные последовательности нуклеотидов и специфично разрывает их. При разрыве образуется серия фрагментов, называемая рестрикционной (рестрикта), с тупыми либо липкими концами. Преимущественно разрывается двунитевая ДНК.

Многие рестриктазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагментов коротких одноцепочечных участков. Они способны образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фрагмента (липкие концы). Липкие концы позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК в одно целое. Полученный фрагмент ДНК можно встроить в очищенную ДНК плазмиды или бактериального вируса.

Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соответствующего участка генома набором рестриктаз позволяет построить рестрикционную карту, отражающую расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке. Сравнением таких карт можно оценить степень гомологии между отдельными генами без определения их нуклеотидной последовательности. Рестрикционные карты важны для клонирования ДНК, решения эволюционных и филогенетических задач.