После того, как была сконструирована нужная ДНК, необходимо использовать её для синтеза планируемого белка.
Экспресс ионные векторы. Обычно для синтеза белка используют экспрессионные векторы – плазмиды, которые содержат синтезированный ген, и активный промотор трансляции. Промотор, который обычно берут из вирусов, стимулирует модифицированную клетку синтезировать большое количество мРНК по плазмидному ДНК-вектору. Наиболее широко используют для этой цели бактериальные клетки. Такие трансформированные клетки синтезируют большое количество нужного белка – порядка 1–10% всего белкового содержимого клетки. Кроме того, преимуществом использования бактерий является их простое культивирование, и достаточно дешевые методы ферментации, что позволяет выращивать большое количество бактериальной культуры, имея скромные ресурсы.
Однако использование бактерий имеет серьезные ограничения. Клетки эукариот часто модифицируют синтезированные белки, а бактерии неспособны осуществлять такие посттрансляционные химические модификации. Вчастности, многие животные и растительные белки имеют углеводные группы на поверхности (гликопротеины), а бактерии не могут осуществить такое гликозилирование белков. Это может иметь фатальные последствия при синтезе белков для медицинских нужд. Многие из таких белков для того, чтобы быть активными должны иметь необходимы углеводные группы, и иммунная система будет бороться с такими немодифицированными белками. Например, необходимость учитывать группу крови при переливании, связана именно с различием в строении углеводных цепей, присоединенных к белкам крови разных групп.
В случаях, когда необходима соответствующая модификация белков, используют клетки дрожжей, насекомых или млекопитающих. Другая проблема, которая возникает при использовании бактерий, это то, что белки начинают агрегироваться, когда их концентрация превышает некоторый уровень, образуя белковые включения в клетках. Такие включения представляют собой плотные белковые агрегаты, различимые в оптический микроскоп и распространяющиеся через всю бактериальную клетку. Они формируются, когда новые белки случайным образом ассоциируются ещё до того, как завершится их фолдинг.
Белковые включения чрезвычайно прочные и для того, чтобы разъединить их отдельные белковые нити необходимо использовать достаточно жесткие внешние условия. Но в большинстве случае в выделенные таким образом индивидуальные полипептидные цепи смогут затем осуществить равильный фолдинг в подходящих условиях. Поэтому, если принципиально возможно выделить в последствии индивидуальный белок из белкового включения, то само наличие таких включений существенным образом помогает выделению белка из клеток после клонирования. Поскольку плотность белковых включений намного выше плотности большинства остальных клеточных компонентов, они легко могут быть отделены от остальных клеточных компонентов простым центрифугированием клеточного экстракта. Бесклеточныйсинтез. Белки могут быть синтезированы также и без помощи живых клеток. Достаточно собрать вместе те компоненты клетки, которые о
— Регулярная проверка качества ссылок по более чем 100 показателям и ежедневный пересчет показателей качества проекта.
— Все известные форматы ссылок: арендные ссылки, вечные ссылки, публикации (упоминания, мнения, отзывы, статьи, пресс-релизы).
— SeoHammer покажет, где рост или падение, а также запросы, на которые нужно обратить внимание.
SeoHammer еще предоставляет технологию Буст, она ускоряет продвижение в десятки раз, а первые результаты появляются уже в течение первых 7 дней. Зарегистрироваться и Начать продвижение
Первый этап производства белка – транскрипцияДНКвмРНК – производится с помощью РНК-полимераз. Однако на втором этапе – при синтезе белков на рибосомах – зачастую возникали трудности при использовании клеточного цитозоля in vitro. Такой клеточный экстракт может не иметь достаточно АТФ, или же, присутствующие в экстракте цитозоля протеазы и нуклеазы разрушают синтезированные белки или мРНК. Для преодоления этих ограничений были созданы специализированные проточные бесклеточные (cell-free) реакторы.
Также успешными были попытки осуществить синтез белков, изготовив искусственную смесь из предварительно выделенных и очищенных компонентов, необходимых для синтеза. Но из-за сложности такой системы, включающей более 100 биокомпонентов, эти попытки пока ограничились воспроизведением условий синтеза белков в самых простых дрожжах. Эти эксперименты были проведены в научных, а не в промышленных масштабах. Но те преимущества, которые имеют бесклеточные технологии синтеза белков, делают их разработку чрезвычайно перспективным делом. Именно с помощью таких технологий можно синтезировать такие белки как мембранные белки, белки-токсины или белки с нестандартными аминокислотами, которые трудно синтезировать в живых клетках бактерий. Разработка бесклеточных трансляционных систем является в настоящее время областью активных исследований молекулярных биологов.