Vinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.x

Генная, или точечная, мутация означает изменение структуры ДНК в одном локусе. Генные мутации приводят к сильным или слабым изменениям морфологических, биохимических и физиологических свойств клетки. Мутации, возникающие в результате изменения макроструктуры хромосом, называются хромосомными мутациями, или хромосомными аберрациями (перестройками).

Генная инженерия — совокупность методик, позволяющих выделять нужный ген из генома одного организма и вводить его в геном другого организма. Растения и животные, в геном которых внедрены «чужие» гены, называются трансгенными, бактерии и грибы — трансформированными. Традиционным объектом генной инженерии является кишечная палочка, бактерия, живущая в кишечнике человека. Именно с ее помощью получают гормон роста — соматотропин, гормон инсулин, который раньше получали из поджелудочных желез коров и свиней, белок интерферон, помогающий справиться с вирусной инфекцией.

Процесс создания трансформированных бактерий включает в себя следующие этапы.

  1. Рестрикция — «вырезание» нужных генов. Проводится с помощью специальных «генетических ножниц», ферментов — рестриктаз.
  2. Создание вектора — специальной генетической конструкции, в составе которой намеченный ген будет внедрен в геном другой клетки. Основой для создания вектора являются плазмиды. Ген вшивают в плазмиду с помощью другой группы ферментов — лигаз. Вектор должен содержать все необходимое для управления работой этого гена — промотор, терминатор, ген-оператор и ген-регулятор, а также маркерные гены, которые придают клетке-реципиенту новые свойства, позволяющие отличить эту клетку от исходных клеток.
  3. Трансформация — внедрение вектора в бактерию.
  4. Скрининг — отбор тех бактерий, в которых внедренные гены успешно работают.
  5. Клонирование трансформированных бактерий.

                      

Образование рекомбинантных плазмид: 1 — клетка с исходной плазмидой; 2 — выделенная плазмида; 3 — создание вектора; 4 — рекомбинантная плазмида (вектор); 5 — клетка с рекомбинантной плазмидой.

Эукариотические гены, в отличие от прокариотических, имеют мозаичное строение (экзоны, интроны). В бактериальных клетках отсутствует процессинг, а трансляция во времени и пространстве не отделена от транскрипции. В связи с этим для пересадки эффективнее использовать искусственно синтезированные гены. Матрицей для такого синтеза является иРНК. С помощью фермента обратная транскриптаза на этой иРНК сперва синтезируется цепь ДНК. Затем на ней с помощью ДНК-полимеразы достраивается вторая цепь.

Структурные перестройки хромосом возникают в результате инверсии, делеции, дупликации, транслокации и транспозиции. Геномные мутации связаны с изменением числа хромосом в ядре, т. е. с изменениями в кариотипе. Вслучаях, когда необходима соответствующая модификация белков, используют клетки дрожжей, насекомых или млекопитающих. Другая проблема, которая возникает при использовании бактерий, это то, что белки начинают агрегироваться, когда их концентрация превышае некоторый уровень, образуя белковые включения в клетках. Такие включения представляю собой плотные белковые агрегаты, различимые в оптический микроскоп и распространяющиеся через всю бактериальную клетку. Они формируются, когда новые белки случайным образом ассоциируются ещё до того, как завершится их фолдинг. Белковые включения чрезвычайно прочные и для того, чтобы разъединить их отдельные белковые нити необходимо использовать достаточно жесткие внешниеусловия. Но в большинстве случаев выделенные таким образом индивидуальные полипептидные цепи смогут затем осуществить правильный фолдинг в подходящиху словиях. Поэтому, если принципиально возможно выделить впоследствии индивидуальный белок из белкового включения, то само наличие таких включений существенным образом помогает выделению белка из клеток после клонирования. Поскольку плотность белковых включений намного выше плотности большинства остальных клеточных компонентов, они легко могут быть отделены от остальных клеточных компонентов простым центрифугированием клеточного экстракта.

Бесклеточныйсинтез. Белкимогутбытьсинтезированытакжеибезпомощиживыхклеток. Достаточнособратьвместетекомпонентыклетки, которыеосуществляютбиосинтезбелков. Первыйэтаппроизвод-ствабелка – транскрипцияДНКвмРНК – производитсяспомощьюРНК-полимераз. Однаконавторомэтапе – присинтезебелковнарибосомах – зачас-туювозникалитрудностиприиспользованииклеточногоцитозоляin vitro. ТакойклеточныйэкстрактможетнеиметьдостаточноАТФ, илиже, присутствующиевэкстрактецитозоляпротеазыинуклеазыразрушаютсинтезированныебелкиилимРНК.

Точечныймутагенез Направленный точечный мутагенез (используется для того, чтобы модифицировать аминокислотную последовательность белка, сделав специфические изменения в структуре гена, кодирующего этот белок. В этом случае мы можем сделать изменения с атомной точностью в структуре белковой цепи, видоизменяя его функции и пространственную структуру. Существует множество методик такого изменения существующих генов. Специфические (точечные) мутации вносятся в ген с помощью специальных олигонуклеотидов

При необходимых условиях этот олигонуклеотид гибридизируется с нитью ДНК, несмотря на несоответствие в данном сайте. Затем ДНК-полимераза достраивает остальную часть второй нити двойной спиралиДНК, используя олигонуклеотид в качестве праймера. После этого такая отредактированная нитьДНК отделяется и по ней как по матрице синтезируется уже мутантная ДНК, содержащая те изменения, которые были сделаны в олигонуклеотиде. Затем используются процедуры клонирования и экспрессии для синтеза модифицированного белка.

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Электронный адрес для связи artemchichkov@gmail.com

^ Наверх