Vinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.xVinaora Nivo Slider 3.x

Методы редактирования геномов, разработанные на основе системы CRISPR-Cas, предполагают разрезание обеих цепей геномной ДНК с последующей починкой двойных разрывов, что чревато ошибками. Альтернативный подход — «редактирование оснований» (base editing) — состоит в химической модификации нуклеотидов без создания двойных разрывов.

Уже разработан метод превращения пар C•G в T•A при помощи фермента цитозиндезаминазы, присоединенного к модифицированному белку Cas9. Для обратного превращения (T•A в C•G) нужен фермент аденозиндезаминаза. Проблема в том, что ни одна из известных аденозиндезаминаз не умеет работать с ДНК. Биоинженеры из Гарвардского университета преодолели это препятствие, создав необходимый фермент при помощи искусственной эволюции. Благодаря этому возможности «редактирования оснований» резко расширились: теперь можно с высокой точностью и с минимумом побочных эффектов осуществлять в живых клетках все четыре транзиции, то есть нуклеотидные замены C→T, G→A, A→G и T→C.

Наиболее популярные сейчас системы редактирования геномов основаны на комбинации белка Cas9 с короткой направляющей, или гидовой, РНК (gRNA). Этот комплекс присоединяется к геномной ДНК там, где последовательность нуклеотидов совпадает с последовательностью gRNA. Таким образом, синтезируя gRNA с разными последовательностями, можно направить Cas9 к тому участку геномной ДНК, который мы хотим отредактировать. Дальше возможны варианты. Исходный, «дикий» вариант Cas9 разрезает обе нити двойной спирали ДНК в указанном месте. После этого клеточные системы репарации ДНК пытаются залатать двойной разрыв, при возможности используя гомологичные фрагменты ДНК в качестве матрицы для восстановления поврежденного участка. Можно ввести в клетку искусственную матрицу и таким образом добиться нужных изменений в репарируемой последовательности.

Однако процесс залечивания двойных разрывов чреват ошибками (в частности, нередко возникают незапланированные вставки и выпадения нуклеотидов — инделы, см. Indel). Поэтому ученые пытаются найти более аккуратные способы редактирования геномной ДНК, не связанные с созданием двойных разрывов. Для этого используют мутантный вариант Cas9 с никазной активностью (никаза — фермент, разрезающий только одну из двух нитей двойной спирали; см. Nickase). На этой основе был разработан метод «редактирования оснований» (base editing), позволяющий аккуратно заменять комплементарную пару оснований C•G на T•A. Для этого к мутантному Cas9 при помощи «мостика» из нескольких аминокислотных остатков пришивают фермент цитидиндезаминазу (см. Cytidine deaminase). Этот фермент превращает цитозин (C) в урацил (U), который при транскрипции и репликации «читается» ферментами-полимеразами как тимин (T). Вторая, комплементарная нить ДНК надрезается белком Cas9, и в ходе починки (репарации) этой нити напротив урацила ставится аденин (А). Техническая трудность состоит в том, что урацила в норме не должно быть в составе ДНК. Ферменты репарации внимательно следят за тем, чтобы никаких урацилов в ДНК не было, а в случае их обнаружения пытаются вырезать «бракованный» фрагмент и выстроить его заново на матрице комплементарной цепи ДНК. Поэтому для того, чтобы система «редактирования оснований» исправно работала, к ней приделывают еще один компонент — ингибитор фермента, вырезающего урацилы из ДНК.

Таким образом, на сегодняшний день уже существует молекулярная конструкция, позволяющая довольно аккуратно менять в геноме комплементарные пары C•G на T•A. Но вот обратную замену (T•A на C•G) столь же аккуратно и без двойных разрывов до сих пор делать не умели. Между тем именно такая замена необходима для исправления 48% известных человеческих однонуклеотидных полиморфизмов с патологическими эффектами (рис. 1, а). Дело в том, что мутация C→T возникает чаще других из-за спонтанного дезаминирования цитозина, а системам репарации не всегда удается ее вовремя исправить.

Данный пробел восполнили специалисты по «редактированию оснований» из Гарвардского университета (США); предварительная версия их статьи опубликована на сайте журнала Nature 25 октября.

Даже самым эффективным и точным современным методам редактирования генома еще далеко до стопроцентной эффективности и абсолютной точности. Но если вспомнить, что с момента расшифровки системы CRISPR-Cas прошло всего-навсего десять лет, то достигнутый прогресс не может не впечатлять. Обсуждаемая работа представляет собой важный шаг на пути к созданию геномных редакторов, достаточно надежных для того, чтобы использовать их для лечения наследственных заболеваний.

Источник: Nicole M. Gaudelli, Alexis C. Komor, Holly A. Rees, Michael S. Packer, Ahmed H. Badran, David I. Bryson & David R. Liu. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage // Nature. Published online 25 October 2017. DOI: 10.1038/nature24644.

© 2015-2019 vseobiology.ru | При использовании материалов сайта - прямая ссылка на vseobiology.ru обязательна.

Электронный адрес для связи artemchichkov@gmail.com

^ Наверх