Методы редактирования геномов, разработанные на основе системы CRISPR-Cas, предполагают разрезание обеих цепей геномной ДНК с последующей починкой двойных разрывов, что чревато ошибками. Альтернативный подход — «редактирование оснований» (base editing) — состоит в химической модификации нуклеотидов без создания двойных разрывов.

Уже разработан метод превращения пар C•G в T•A при помощи фермента цитозиндезаминазы, присоединенного к модифицированному белку Cas9. Для обратного превращения (T•A в C•G) нужен фермент аденозиндезаминаза. Проблема в том, что ни одна из известных аденозиндезаминаз не умеет работать с ДНК. Биоинженеры из Гарвардского университета преодолели это препятствие, создав необходимый фермент при помощи искусственной эволюции. Благодаря этому возможности «редактирования оснований» резко расширились: теперь можно с высокой точностью и с минимумом побочных эффектов осуществлять в живых клетках все четыре транзиции, то есть нуклеотидные замены C→T, G→A, A→G и T→C.

Наиболее популярные сейчас системы редактирования геномов основаны на комбинации белка Cas9 с короткой направляющей, или гидовой, РНК (gRNA). Этот комплекс присоединяется к геномной ДНК там, где последовательность нуклеотидов совпадает с последовательностью gRNA. Таким образом, синтезируя gRNA с разными последовательностями, можно направить Cas9 к тому участку геномной ДНК, который мы хотим отредактировать. Дальше возможны варианты. Исходный, «дикий» вариант Cas9 разрезает обе нити двойной спирали ДНК в указанном месте. После этого клеточные системы репарации ДНК пытаются залатать двойной разрыв, при возможности используя гомологичные фрагменты ДНК в качестве матрицы для восстановления поврежденного участка. Можно ввести в клетку искусственную матрицу и таким образом добиться нужных изменений в репарируемой последовательности.

Однако процесс залечивания двойных разрывов чреват ошибками (в частности, нередко возникают незапланированные вставки и выпадения нуклеотидов — инделы, см. Indel). Поэтому ученые пытаются найти более аккуратные способы редактирования геномной ДНК, не связанные с созданием двойных разрывов. Для этого используют мутантный вариант Cas9 с никазной активностью (никаза — фермент, разрезающий только одну из двух нитей двойной спирали; см. Nickase). На этой основе был разработан метод «редактирования оснований» (base editing), позволяющий аккуратно заменять комплементарную пару оснований C•G на T•A. Для этого к мутантному Cas9 при помощи «мостика» из нескольких аминокислотных остатков пришивают фермент цитидиндезаминазу (см. Cytidine deaminase). Этот фермент превращает цитозин (C) в урацил (U), который при транскрипции и репликации «читается» ферментами-полимеразами как тимин (T). Вторая, комплементарная нить ДНК надрезается белком Cas9, и в ходе починки (репарации) этой нити напротив урацила ставится аденин (А). Техническая трудность состоит в том, что урацила в норме не должно быть в составе ДНК. Ферменты репарации внимательно следят за тем, чтобы никаких урацилов в ДНК не было, а в случае их обнаружения пытаются вырезать «бракованный» фрагмент и выстроить его заново на матрице комплементарной цепи ДНК. Поэтому для того, чтобы система «редактирования оснований» исправно работала, к ней приделывают еще один компонент — ингибитор фермента, вырезающего урацилы из ДНК.

Таким образом, на сегодняшний день уже существует молекулярная конструкция, позволяющая довольно аккуратно менять в геноме комплементарные пары C•G на T•A. Но вот обратную замену (T•A на C•G) столь же аккуратно и без двойных разрывов до сих пор делать не умели. Между тем именно такая замена необходима для исправления 48% известных человеческих однонуклеотидных полиморфизмов с патологическими эффектами (рис. 1, а). Дело в том, что мутация C→T возникает чаще других из-за спонтанного дезаминирования цитозина, а системам репарации не всегда удается ее вовремя исправить.

Данный пробел восполнили специалисты по «редактированию оснований» из Гарвардского университета (США); предварительная версия их статьи опубликована на сайте журнала Nature 25 октября.

Даже самым эффективным и точным современным методам редактирования генома еще далеко до стопроцентной эффективности и абсолютной точности. Но если вспомнить, что с момента расшифровки системы CRISPR-Cas прошло всего-навсего десять лет, то достигнутый прогресс не может не впечатлять. Обсуждаемая работа представляет собой важный шаг на пути к созданию геномных редакторов, достаточно надежных для того, чтобы использовать их для лечения наследственных заболеваний.

Источник: Nicole M. Gaudelli, Alexis C. Komor, Holly A. Rees, Michael S. Packer, Ahmed H. Badran, David I. Bryson & David R. Liu. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage // Nature. Published online 25 October 2017. DOI: 10.1038/nature24644.